一、流式细胞术在探测小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病人中的应用（论文文献综述）
张旭[1]（2020）在《HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究》文中提出研究目的艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的一种慢性传染病,主要传播途径包括血液接触,母婴传播和性传播三种,因其具有致命性,且尚无彻底治愈药物的特点,成为威胁人类健康的主要疾病之一。艾滋病未能得以根治的主要原因是有病毒储藏库的存在。目前的联合抗逆转录病毒治疗方法（cART）主要靶向艾滋病毒编码蛋白中的三种酶活性蛋白。但15种HIV编码蛋白中还有许多潜在的病毒机制及可能的药物靶点仍未得到充分研究。为了清除HIV-1的病毒储藏库,已经开发出各种治疗策略,其中包括“HIV-1病毒储藏库的震和杀”（“shock and kill”）。“shock and kill”研究的关键问题之一是如何修复HIV-1感染受损的免疫系统,恢复宿主的免疫监控,以达到清除病毒的效果。长期以来HIV-1的Nef蛋白可以通过介导细胞表面MHC-I的下调,帮助HIV-1逃避免疫系统的监控。寻找一种新型的特异性拮抗Nef下调MHC-1的抗病毒药物具有重大的学术价值和应用价值。本研究试图从FDA批准已经在临床上使用的化合物库中希望筛选一个能够特异性拮抗Nef蛋白的抗病毒药物,从而恢复细胞表面的MHC-I的表达,增加免疫系统对HIV-1感染细胞的应答反应,为临床上增强对HIV-1的免疫监控提供一种新的治疗策略。研究内容和方法首先,本研究利用分子克隆技术构建HIV-1 Nef-GFP蛋白稳定表达的荧光载体系统,通过细胞转染,流式细胞术等方法,在HEK293T细胞中验证Nef-GFP表达载体能够有效抑制细胞表面MHC-I的表达。进一步再通过高通量药物筛选,筛选出Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂洛伐他汀。其次,通过病毒的包装和体外扩增,过表达Nef和SERINC5,ELISA等实验方法,验证洛伐他汀是否能够抑制同样被Nef下调的CD4和SERINC5,并抑制由Nef引起的病毒复制能力。通过病毒体外感染,共培养等实验来检测洛伐他汀是否促进自体的细胞毒性T淋巴细胞通过免疫杀伤反应清除感染细胞,并进一步测试洛伐他汀抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹,验证洛伐他汀的抗病毒效果。最后,通过分子对接实验、位点突变、和免疫共沉淀方法,探讨洛伐他汀特异性拮抗Nef蛋白恢复MHC-I表达的分子机制。研究成果本研究通过流式高通量药物筛选系统对FDA批准已在临床上广泛使用的的药物库进行药物筛选工作,我们发现一种他汀类药物洛伐他汀,不仅可以显着拮抗Nef蛋白下调MHC-I的表达,还可以拮抗Nef抑制的CD4和SERINC5的表达,并在野生型HIV-1病毒感染的CD4+T细胞中验证了洛伐他汀对MHC-1和CD4的下调有抑制作用,抑制作用呈现剂量依赖性。体外CD4+T细胞自体感染实验和自体CD8+T细胞共培养实验中,加入特定组合的HIV-1抗原肽模拟体内病毒感染情况,发现洛伐他汀处理后,感染细胞中病毒复制被有效并持续的抑制,说明洛伐他汀能有效抑制病毒颗粒的内源性感染性。通过细胞杀伤实验检测结果,发现洛伐他汀处理后,感染的CD4+T细胞的CTLs杀伤毒性显着增加,表明洛伐他汀还可以促进自体CTLs,并且有效抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹。另外,我们通过分子对接实验,计算洛伐他汀可能与Nef-MHC-I复合物作用的位点,并通过分子突变实验加以证实。我们还发现洛伐他汀通过直接与Nef蛋白作用,干扰Nef-MHC-AP-1复合物的形成,从而抑制Nef蛋白对MHC-I的下调。结论本研究筛选出一种有前景的抗HIV-1病毒药物洛伐他汀。洛伐他汀可以拮抗Nef介导的MHC-I、CD4和SERINC5的下调,增强CD8+T细胞的CTLs反应,抑制病毒的复制,有助于临床上增强抗HIV-1的免疫监控呼吸道合胞体病毒（RSV）是最常见的呼吸道病毒,它与儿童肺炎、细支气管炎和婴幼儿死亡率显着相关。Micro RNAs（mi RNAs）是一种内源性非编码小RNAs,在基因调控中发挥作用,并与宿主免疫反应和疾病进展相关。在本研究中,为了识别儿童肺炎相关潜在的生物标志物,同时研究RSV相关儿童肺炎的分子机制,我们分析了患RSV轻症肺炎和重症肺炎儿童全血样本的全转录组和微小RNA组。我们发现RSV重症肺炎患儿全血mi RNAs和编码RNA（m RNA）表达谱发生改变,差异明显。在RSV重症肺炎患儿中,hsa-mi R-1271-5p、hsa-mi R-10a-3p、hsa-mi R-125b-5p和hsa-mi R-30b-3p这四种mi RNAs被显着上调。进一步,我们对RSV重症肺炎的特异性mi RNA的靶标基因进行了比较。利用基因功能富集分析法（GO分析）对这些靶基因进行分析,发现大多数靶基因参与炎症和免疫反应,包括NF-k B信号通路、MAPK信号通路和T细胞受体信号通路。我们的发现将有助于识别重症肺炎的生物标志物和新的药物设计策略,并用用以治疗的RSV重症肺炎儿童。
孙伊娜[2]（2019）在《MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究》文中研究指明随着诊断及治疗方法的不断改进,目前国内外儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治愈率已经比较高,但仍有一些儿童难治或复发,其中混合谱系白血病（MLL）基因重排儿童ALL是公认的预后不良类型之一。不同年龄、伙伴基因、治疗策略和早期治疗反应对MLL基因重排白血病预后有很大差异。随着二代测序技术的日益成熟,RNA-seq技术逐步应用于白血病的基因诊断,对于精准的鉴定不良预后基因,显得极为重要。本研究从临床特征、治疗反应及差异表达基因几个方面分析和研究MLL重排阳性儿童ALL预后不良因素,为进一步分层及个体化治疗奠定基础。第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析目的:探讨MLL基因重排儿童ALL接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后相关因素。方法:2008年4月至2015年10月共227例ALL患儿接受CCLG-ALL2008高危组方案治疗,其中MLL阳性30例,BCR/ABL阳性24例,MLL和BCR/ABL双阴性173例,MLL阴性197例。MLL阳性组分别与BCR/ABL 阳性组、MLL及BCR/ABL双阴性组和MLL阴性组比较临床特征和治疗反应,并长期随访,对组间及组内进行生存分析。结果:1、MLL阳性组与其它组比较:年龄<2岁比例较其他组明显增高;第15天骨髓非M1（原始+幼稚细胞<5%）比例明显低于阴性组和双阴性组;第33天完全缓解（CR）患儿较BCR/ABL 阳性组明显增高;第33天骨髓MRD≥1×10-2比例较BCR/ABL 阳性组明显低。10年总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）MLL阳性组比BCR/ABL 阳性组高。2、MLL阳性组内比较:年龄<2岁患儿10年OS和RFS显着低于年龄≥2岁患儿。强的松不敏感患儿10年OS和RFS显着低于强的松敏感患儿。第33天未缓解（NR）组10年OS和RFS显着低于CR组。多变量COX回归分析发现:年龄、基因重排形式、强的松反应对患儿生存期有影响。结论:CCLG-ALL2008高危组方案对于年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松反应不敏感和第33天未缓解患儿治疗效果不佳;年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松不敏感以及第33天未缓解与MLL重排儿童ALL预后不良相关。第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性目的:应用RNA-seq技术鉴定MLL基因及伙伴基因,通过分析差异表达基因,推测预后不良基因。方法:1、2014年4月至2018年4月在苏州大学附属儿童医院接受正规治疗的15例MLL重排阳性及5例阴性儿童ALL病例,用RNA-seq测定基因表达及鉴定伙伴基因。2、差异表达基因（DEGs）通过Cuffdiff算法来分析,并对DEGs进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,通过分析前20个差异最显着DEGs富集到有意义的GO功能和KEGG信号通路,筛选出预后相关基因。结果:1、通过RNA-seq 15例ALL病例全部鉴定出MLL基因及伙伴基因。2、差异表达基因分析发现,MLL重排阳性组对阴性组,复发组对未复发组,泼尼松耐药组对敏感组,存在明显的差异表达基因;前20上调DEGs富集到有意义的GO功能和 KEGG 信号通路,MLL 阳性组有:CCNA1、LAMP5、CXCL8、MAP7、IL1RL1、NTRK1、PROM1;复发组中有:IL1RL1、GATA2、IL5RA、CXCL8、CXCR2、CXCR1。结论:1、RNA-seq鉴定融合基因非常精准,有望成为白血病分子生物学诊断新方法。2、CXCL8、IL1RL1、CCNA1、LAMP5、PROM1、GATA2、CXCR2 以及 CXCR1高表达可能与MLL重排阳性儿童ALL预后不良相关。
刘燕[3]（2019）在《免疫表型与儿童急性髓系白血病临床特征和预后的相关性分析》文中提出目的:儿童急性髓系白血病（AML）发病率低,单中心病例数少,方案缺乏统一性,免疫表型与儿童急性髓系白血病（AML）临床特征和预后的相关性研究结论不一。本研究对本中心历时6年,入组的183例患儿的免疫表型和临床特征及预后进行分析,以期评估儿童AML不同免疫表型对生物学特征和预后的影响。方法:选取苏州大学附属儿童医院自2012年7月14日至2018年5月15日所有初诊的AML儿童（除外PML-RARA阳性的M3患儿、混合细胞白血病患儿）共183人,诊断采用MICM分型诊断,治疗按危险度分层标准进行统一方案分层治疗。用流式细胞仪进行免疫表型分析,将各免疫表型分为阳性组和阴性组,阳性组为实验组,阴性组为对照组。将免疫表型结果分为4类:1、髓系免疫标志MPO（阳性/阴性:163/20）,CD13（阳性/阴性:68/115）,CD33（阳性/阴性:140/43）,CD11b（阳性/阴性:86/42）,CD64（阳性/阴性:83/47）,CD36（阳性/阴性:43/43）,CD14（阳性/阴性:23/160）,CD15（阳性/阴性:111/60）,CD117（阳性/阴性:116/67）;2、巨核系细胞标志CD41（阳性/阴性:9/174）;3、淋系相关抗原CD19（阳性/阴性:38/145）,CD7（阳性/阴性:26/157）,CD2（阳性/阴性:14/169）;4、干祖细胞相关免疫标志CD34（阳性/阴性:142/41）,HLA-DR（阳性/阴性:155/28）,CD123（阳性/阴性:124/39）。各免疫表型患儿2个诱导缓解治疗方案的缓解率的比较采用χ2检验;免疫表型的生存分析采用Kaplan-Meier方法,生存之间的比较采用log-rank检验;COX比例风险模型用于分析各免疫表型是否为独立预后因素。二分类Logistic回归分析免疫疫表型的相关危险因素。p<0.05有统计学意义。结果:1、单因素分析显示:1)CD15+表达的AML患儿第一、二诱导缓解治疗方案的完全缓解（CR）率分别为90.1%和94.4%,明显高于阴性组,后者CR率为9.9%和5.6%（p=0.023、p=0.013）。2)CD11b阳性组的长期生存率（OS）明显较阴性组差,p=0.04,提示CD11b阳性为预后不良因素。3)CD117阳性组和伴淋系抗原阳性组OS均明显优于各自阴性组,提示CD117阳性和伴淋系抗原表达为预后良好因素（p值均为p=0.03）。2、多因素COX比例风险分析显示各免疫表型均无独立的预后价值。3、二分类Logistic回归分析:1)MLL、HOX11或BCR/ABL融合基因阳性患儿的CD15阳性可能性大;2)初诊白细胞高、危险度高的患儿CD1 1b阳性表达可能性大,无CEBPα双突变、C-KIT、FLT3-ITD或ASXL1突变的患儿CD11b阳性表达可能性大;3)年龄大者CD117阳性表达可能性大、高危及复杂核型患儿的CD117阳性表达可能性小;4)没有影响CD19表达的独立因素。5)MLL、HOX11或BCR/ABL融合基因阳性患儿Ly阳性表达可能性小。结论:1、CD15阳性AML患儿的诱导缓解疗效优于阴性者。2、儿童AML患儿的免疫表型对预后有一定影响,但不能单独用于治疗前危险度的评估,需要多参数联合评估。
易甜甜[4]（2018）在《GD2008方案治疗298例急性淋巴细胞白血病的长期生存分析》文中认为目的:研究GD2008方案治疗儿童急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）的治疗效果、化疗强度、并发症及预后影响因素。方法:对2008年1月1日至2015年12月31日期间经南方医院儿科接诊治疗的298例ALL患儿纳入临床分析。根据初诊时年龄、外周血白细胞数、对强的松7天治疗反应、t（9:22）、t（4:11）移位,融合基因（BCR/ABL和MLL/AF4）检测及D15及D33骨髓缓解情况,分为标危（Standard risk,SR）、中危（Medium risk,IR）及高危组（High risk,HR）。治疗方案为:诱导缓解VDLD+CAM,巩固治疗HDMTX（SR、IR）/BLOCK（HR）+再诱导VDLD+再诱导CAM+维持（A方案/B方案）,部分HR组患者选择骨髓完全缓解后行造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）。标危组总疗程为 1 02 周,中危组106周,高危组女孩2年,男孩2.5年。结果:298例患者中,男性196例,女性106例,年龄0.6-15.1岁（中位年龄5岁）,SR组64例,IR组142例,HR组88例,未定危险分层4例。随访至2018年1月1日,中位随访时间57个月（范围:1-113个月）,存活215例,死亡40例,失访15例,失访率为5.0%。3年及5年总生存率（OS）分别为87.5±2.0%、84.9±2.2%;3 年及 5 年无事件生存率（EFS）分别为 83.2±2.3%、78.4±2.6%;SR、IR、HR 组 3 年 EFS 分别为 89.8±3.9%、86.6±2.9%、72.6±5.2%,5 年 EFS 分别为 89.8±3.9%、82.6±3.3%、66.2±5.7%,HR 组长期 EFS 明显低于 SR 及 IR 组,差异存在统计学意义（P=0.008）。255例强的松7天反应佳（85.6%）;D15天骨髓 M1 者 173 例（58.1%）,D33 天骨髓 M1 者 274 例（91.9%）。CR 率为96.3%（n=287）。30例化疗过程中放弃治疗,SR、IR、HR组放弃率分别为:7.8%（n=5）、4.2%（n=6）、18.2%（n=16）,HR 组放弃率更高（P<0.001）;医保及自费患者放弃率分别为5.5%（n=8）、14.5%（n=22）,自费患者放弃率高于医保患者（P=0.01）。复发率为14.1%（n=42）,其中30例骨髓复发,8例中枢复发,2睾丸白血病复发,2例中枢+骨髓复发。男性19.1%（n=34）,女性8.4%（n=8）,男性复发率高于女性（P=0.016）。死亡率为13.4%（n=40）。化疗相关死亡12例,诱导缓解阶段占75%（n=9）。化疗相关并发症主要为感染、黏膜炎、心肌损害、症状性糖尿病、不全性肠梗阻、中枢损害、继发性高血压、胰腺炎、二次肿瘤。单因素分析提示性别、发病年龄、危险度、D33骨髓缓解情况、免疫分型、分类、初诊外周血白细胞计数、粒缺伴发热、药物性肝损害、中枢损害、症状性糖尿病、心脏损害、不全性肠梗阻、胰腺炎、BCR/ABL基因阳性与长期EFS相关。多因素COX回归分析结果示:女性是长期EFS的独立保护性因素;发病年龄≥10岁、初诊外周血白细胞计数≥50×109/L、D33骨髓未缓解、化疗相关胰腺炎胰腺炎是长期EFS的独立危险因素。结论:298例患者3年EFS为83.2±2.3%,5年EFS为78.4±2.6%,HR组化疗效果较差;CR率为96.3%,复发率为14.1%,死亡率为13.4%;诱导缓解阶段化疗相关死亡率最高,HR组BLOCK阶段化疗强度大,并发症多且严重;女性是长期EFS的独立保护性因素,发病年龄≥10岁、初诊外周血白细胞计数≥50×109/L、D33骨髓未缓解以及化疗相关胰腺炎是长期EFS的独立危险因素。
文钦[5]（2017）在《CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制》文中提出背景:造血干细胞移植是治疗急性白血病的有效手段,自体造血干细胞移植具有适用范围广、费用较少、安全性高等优点,但是移植后患者的复发率较高。微小残留病（Minimal Residual Disease,MRD）清除不彻底是其根源。造血微环境对白血病的生长、支持、庇护是白血病残留的重要因素。基质细胞是造血微环境的主要成分,具有调控白血病细胞生长、浸润,介导白血病的残留及耐药的作用。间隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication,GJIC）是相邻细胞间普遍存在的直接通讯方式。间隙连接蛋白43（connexin43,CX43）介导的GJIC广泛存在于骨髓基质细胞、基质细胞与造血细胞之间,是骨髓基质参与造血调控的必要条件。GJIC减弱或缺失在实体肿瘤的发生发展中起着重要作用。我们前期对急性白血病患者的骨髓基质细胞进行检测发现,其CX43表达明显降低,GJIC功能也明显减弱,对白血病的阻抑作用减弱;临床研究发现,自体造血干细胞移植后患者的GJIC功能长时间处于较低水平,导致骨髓微环境对白血病的阻抑作用减弱,可能是残留白血病易复发的因素。人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCSCs）在体外对白血病细胞株具有抑制增殖及促进凋亡的作用,体内能归巢至骨髓修复造血微环境。能否利用人脐血源基质细胞这一基因载体和对白血病细胞具有阻抑作用的特性,将Cx43基因转染新型人脐血源基质细胞与自体造血干细胞联合移植给预处理后的微小残留病小鼠模型,起到重建移植后GJIC功能以净化小鼠微小残留病的作用,从而降低自体移植后白血病的复发是值得验证的科学设想。本课题为国家自然科学基金项目（No.81070388）“CX43修饰人脐血源基质细胞移植对自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation,AHSCT）后残留白血病净化效应及机制研究”的研究内容。试图从改造白血病造血微环境功能GJIC角度去影响白血病细胞的增殖、分化过程,从而达到去恶化的目的,为探寻白血病治疗的新方法,积累理论和实验依据奠定基础。目的:观察Cx43修饰的新型人脐血源基质细胞移植在造血干细胞移植后的微小残留白血病小鼠骨髓微环境的定植和对异常骨髓微环境的修复作用,通过修复和增强移植后小鼠骨髓基质GJIC功能,改善骨髓微环境造血调控功能,实现对小鼠残留白血病体内净化。方法:1.CX43重组腺病毒载体（Ad-Cx43-GFP）转染人脐血源基质细胞按本科室已经建立的方法对健康产妇脐带血进行细胞分离并贴壁培养,获得人脐血源基质细胞。按我科常规方法构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞。分别用免疫荧光法、PCR、Western-Blot、光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photo bleaching,FRAP）检测转染后Cx43表达。2.构建人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系,体外观察CX43转染前后人脐血源基质细胞对L615白血病细胞的调节作用实验分三组:1)阴性对照组:L615细胞单独培养;2)hUCSCs/L615组:人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组3)Ad-Cx43-hUCSCs/L615组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组CCK8法检测共培养后L615细胞的生长曲线,对比各组间L615细胞增殖率;流式细胞术检测共培养后L615细胞的凋亡率及细胞周期;Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达情况。3.构建L615白血病MRD小鼠模型,进行人脐血源基质细胞联合自体造血干细胞移植,观察转染后人脐血源基质细胞对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应将L615细胞经尾静脉注入L615同系小鼠,3天后经腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,从而获得L615白血病MRD小鼠模型。实验分为两组:1)BM组:骨髓造血干细胞移植组2)Ad-Cx43-hUCSCs+BM组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞联合骨髓造血干细胞移植组以残留白血病L615为受体鼠,以正常L615为供鼠,受鼠在第0天接受6.0 Gy 60Coγ射线TBI;照射后6 h,经尾静脉注射来自供鼠的骨髓造血干细胞细胞以及CM-Dil标记的Cx43修饰的人脐血源基质细胞,其中,BM组输注骨髓细胞为2×106个/只、Ad-Cx43-hUCSCs+BM组输注骨髓细胞及人脐血源基质细胞各1×106个/只。对不同组小鼠移植后尾静脉血行血常规检查以观察造血重建情况;对不同组小鼠移植后的骨髓进行涂片及骨髓病理切片检查;利用荧光标记追踪Ad-Cx43-hUCSCs移植后体内分布情况;对移植后小鼠的骨髓基质细胞进行GJIC功能检测,于移植后不同时间点分别取肝脏、脾脏、肺、肾脏进行病理切片及HE染色;观察各组小鼠移植后的生存率。结果:1.成功构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞:转染后24h可见绿色荧光表达,48h荧光表达达到峰值,转染效率（89.30±3.12）%。免疫荧光、RT-PCR以及Western-Blot证实CX43基因修饰后的hUCSCs Cx43表达水平较未转染组显着升高（CX43mRNA升高2倍,CX43蛋白表达升高3倍）（p<0.05）。进一步检测GJIC功能,结果显示:Ad-Cx43-GFP组细胞在漂白后40s时的荧光与淬灭前水平基本相当,而对照组无法恢复。2.CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞的影响:1)以含20%胎牛血清的DMEM+PRMI1640混合培养基作为培养液,成功建立了两种细胞的体外接触共培养体系,共培养72h后,显微镜下可见基质细胞与L615细胞直接接触,电镜下能清晰的看到基质细胞粘附、包裹L615细胞。2)CCK8法检测细胞增殖:共培养48h,转染Cx43组L615细胞增殖受到明显抑制,直接测得OD值,Cx43转染组明显小于其余各组,两两间比较,Cx43转染组与另外两组差异均有统计学意义（p<0.05）。提示自共培养48h起,转染Cx43组L615细胞活力明显降低,存活率明显降低（p<0.05）。3)流式细胞仪检测细胞凋亡:转染CX43组L615细胞凋亡率为9.70±0.83%,明显高于未转染组（7.33±0.74%）和阴性对照组（2.50±0.85%）,差异有显着性（p<0.05）。4)流式细胞仪检测细胞周期:Cx43转染组G0/G1期细胞比例约为80.43%,较阴性对照组（84.43%）降低（P<0.05）;Cx43转染组S期细胞比例为10.42%,较阴性对照组（6.38%）升高（P<0.05）。G2/M期细胞比例Cx43转染组（8.52%）与单独培养组（8.15%）相似（P>0.05）。未转染组各细胞周期的比例与单独培养组无统计学差异。5)Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达:Cx43转染组caspase3表达较对照组升高1.8倍（P<0.05）。Cx43转染组caspase7表达较对照组升高7倍（P<0.05）。caspase6表达各组间无明显差异（P>0.05）。3.Ad-Cx43-hUCSCs对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应:第0天以L615细胞经尾静脉注射L615同系小鼠致白血病,细胞量2×106个/只,于接种+5天即在外周血中查见白血病细胞,接种+8天骨髓、肝脏、脾脏均查见大量白血病细胞浸润,平均存活时间:11±1.71天。第3天经腹腔注射环磷酰胺,200mg/kg,化疗后+5天白细胞明显降低,化疗后+7天白细胞数开始回升,+17天接近正常,此时骨髓、肝脏、脾脏均未查见白血病细胞,于+23天疾病复发,平均存活时间27.33±2.49天。提示治疗后L615模型小鼠能达到完全缓解,存活时间延长,但体内仍有白血病残留,最后复发。1)Ad-Cx43-hUCSCs体内分布情况:移植后24小时即在小鼠骨髓、肝脏、脾脏、肺脏均能检测到Ad-Cx43-hUCSCs,移植+7天,骨髓、肝脏、脾脏中红色荧光细胞数量增加,荧光强度减弱,肺脏中红色荧光标记细胞减少。移植+14天,骨髓及其他脏器均不能查见红色荧光标记的细胞。2)移植小鼠血象变化情况:移植后,Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠白细胞从+8天开始、血小板从+11天开始回升速度明显快于BM组（P<0.05）比较差异具有统计学意义（P<0.05）。3)FRAP检测两组小鼠骨髓基质细胞的GJIC功能:BM+Ad-Cx43-hUCSCs联合移植组,骨髓基质细胞的荧光强度在淬灭后5min内恢复69.33±1.25%,较BM单独移植组（51.67±1.7%）明显增高,有统计学意义（P<0.05）。4)人脐血源基质细胞移植骨髓涂片和病理切片的变化:移植+17天,骨髓涂片显示,Cx43+hUCBDSCs+BM组未查见白血病细胞浸润（p<0.05）,BM组有大量白血病细胞浸润（图11）。骨髓活检显示:Cx43+hUCBDSCs+BM组未见白血病细胞,BM组骨小梁减少,细胞形态偏幼稚,成簇、成团分布（图12）。5)各组小鼠移植后28天内的生存率:Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠平均生存时间为26.9±1.52天,较BM组（23.70±1.99天）延长（p<0.05）Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠死亡率20%,较BM组35%降低（p<0.05）。结论:1.CX43基因腺病毒可成功转染hUCSCs,Ad-Cx43-hUCSCs的CX43表达水平上调,GJCI功能增加;2.成功建立人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系:Ad-Cx43-hUCSCs与L615细胞株共培养可抑制L615细胞增殖,上调L615细胞caspase3、7表达水平,促进其凋亡;3.Ad-Cx43-hUCSCs联合自体造血干细胞移植后,可归巢至骨髓、脾脏、肝脏、肺等器官;联合移植可促进小鼠造血重建;使骨髓基质细胞GJIC功能增强,有助于清除残留白血病,延长移植小鼠生存。
袁静[6]（2016）在《采用CCLG-2008方案治疗的儿童急性淋巴细胞性白血病复发因素分析》文中提出目的:分析CCLG-2008方案治疗儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）复发危险因素,为优化儿童ALL治疗方案奠定基础。方法:回顾性分析2008年12月1日至2012年12月31日初诊且均使用CCLG-2008方案化疗的358例ALL患儿随访至2015年9月1日的复发情况及相关影响因素。结果:358例纳入ALL患儿中,男性219例、女性139例,男女比例:1.57:1,中位年龄51个月（5199个月）,中位随访时间52个月（4-82个月）。其中复发79例,未复发279例。未复发279例患儿中,治疗相关性死亡4例,失访5例,这9例不进入单因素分析。总复发率:22.1%（79/358）,总生存率86.3%（309/358）。79例复发患儿,男性患儿为48例,女性为31例,男女比例为1.55:1.00;年龄<10岁为66例,≥10岁患儿为13例。入选研究的270例ALL未复发患儿为阴性对照,男性患儿为166例,女性为104例,男女比例为1.60:1.00;年龄<10岁为250例,≥10岁患儿为20例。通过卡方检验,复发组与未复发组男女构成比差异无统计学意义,χ2值=0.013,P=0.91。复发组中,初诊年龄>10岁比率高于未复发组,χ2值=5.8,P=0.015,差异有统计学意义。单纯骨髓复发64人;单纯髓外复发共8人,其中单纯睾丸复发6人,其中1人治疗1年后发生中枢神经系统复发;单纯中枢神经系统复发2人;骨髓联合睾丸复发3人,骨髓联合中枢神经系统复发4人。高危组、中危组、标危组的复发率分别为41.3%、17.6%、13.3%,极早期、早期和晚期复发率分别为31.6%、36.7%和31.6%。对79例复发患儿中,标危组极早期复发4例、早期复发5例、晚期复发9例;中危组极早期复发9例、早期复发8例、晚期复发6例;高危组极早期复发12例、早期复发16例、晚期复发10例,使用精确概率法P=0.45,无统计学意义。标危、中危、高危组中位复发时间（复发距初诊时间）分别为:31.2、20.5、22.7月。但仅研究B系ALL患儿复发时间频数分布图,标危组患儿复发集中在晚期,中危组集中在极早期及早期,高危组在早期及晚期各有一高峰。Cox回归统计显示,初诊白细胞计数>100×109/L、第15天骨髓M3（骨髓涂片中原始+幼稚细胞比例≥25%）、第12周微小残留病灶（MRD）>10-4的患儿复发率高,其相对危险度及95%置信区间分别为3.17（1.586.36）、1.87（1.073.30）、1.90（1.123.20）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:高危组CCLG-2008方案患儿复发率高;初诊白细胞计数、第15天骨髓呈现M3、第12周MRD>10-4是ALL复发的重要危险因素。
林义[7]（2014）在《人胚胎发育相关微小RNA的鉴定及功能研究》文中研究表明精细而准确的基因调控对于人类胚胎的正常发育至关重要,而肿瘤的发生在一定意义上是胚胎基因表达的结果。在过去十多年研究发现,微小RNA作为-类长度大约在19-25nt的小分子非编码RNA,在基因转录后调控中发挥着重要作用,参与了众多的生理或病理过程,包括胚胎的发育、肿瘤发生和血细胞生成等。近年来,在斑马鱼、小鼠等模式动物胚胎发育过程中微小RNA的表达模式已经有详尽的研究。本实验室在完成人类早期胚胎发育过程中全基因组表达谱研究基础上,对微小RNA在这一过程中的表达模式展开了研究,鉴定了与人类胚胎发育和肿瘤发生相关的微小RNA,并研究了其中之一hsa-miR-638在白血病细胞增殖与分化中的功能。我们的研究将为揭示微小RNA的功能提供科学证据。类似于基因表达谱分析,我们调查了人类所有已知（miRBase10.1版本）微小RNA在人类胚胎发育过程中的表达模式。通过分析胚胎发育早期4-6周的微小RNA芯片,鉴定了50个人胚胎发育相关的微小RNA,并且比较了与小鼠对应时期胚胎发育中的微小RNA表达谱的共性和独特性。这项研究结果为我们全面认知微小RNA在胚胎发育中的调控作用奠定了重要基础。相关文献报道人类胚胎发育与肿瘤发生之间存在很多的相似性,推测参与胚胎发育的微小RNA也可能与肿瘤的发生相关。因此,我们选取了其中3个灵长类特异或非保守的微小RNA,即hsa-miR-638, hsa-miR-720和hsa-miR-1280,通过原位杂交的方法定性分析了三者在人类各种实体瘤和相应正常组织中的表达水平。结果表明,这些微小RNA分别在人胃癌、皮肤癌和宫颈癌等多种肿瘤中异常表达,提示它们可能与多种实体瘤的发生密切相关。这些结果也进一步为阐述人类早期胚胎发育与肿瘤发生之间的相关性提供了新的证据。众所周知,血细胞生成也是发育中的重要组成部分,调控异常往往导致白血病的发生,而微小RNA广泛参与了正常和异常的造血生成过程。其中,我们观察到miR-638在正常髓系细胞中表达显着上升,而在原代急性髓系白血病细胞中明显下调。提示,miR-638可能与髓系细胞的分化相关,异常调控可能参与白血病的发生。为此,我们对miR-638在白血病细胞增殖与分化中的功能展开深入地的研究。研究发现,原代和传代髓系白血病细胞在经过化疗药物（弗波酯、全反式维甲酸）诱导分化时,miR-638表达显着上升,再次提示了miR-638可能参与髓系细胞的终末分化。进一步实验显示,在白血病细胞系中过表达miR-638能显着促进化疗药物诱导的髓系分化；而抑制miR-638表达则阻止细胞分化。同样地,在髓系白血病细胞系HL-60中过表达miR-638还导致细胞周期被阻滞在G1期、细胞增殖和克隆形成能力也受到抑制。这些结果表明,miR-638促进髓系细胞的终末分化,其表达下调参与了白血病的的发生微小RNA通过调节靶基因调控众多生理或病理过程。我们预测并通过双荧光素酶试验和定点突变的方法证实周期蛋白依赖的激酶2（CDK2）为miR-638的靶基因之一。在白血病细胞中,CDK2蛋白的表达水平与miR-638呈现负相关性。通过反义RNA技术下调CDK2的表达,能模拟过表达miR-638促进髓系终末分化的表型；在HL-60中,过表达CDK2则能抵消因过表达miR-638而导致的细胞克隆形成能力下降。这些结果表明,异常下调的miR-638可能导致CDK2表达升高从而影响白血病的发生综上所述,我们从调查人类早期胚胎发育过程中的微小RNA表达谱出发,发现部分微小RNA与多种细胞恶变或肿瘤发生密切相关,包括急性髓系白血病。其中,miR-638可能通过靶向CDK2来控制髓系终末分化,其异常表达参与了髓系白血病的发生。本研究初步揭示了人类胚胎发育调控的分子机制,丰富人们对微小RNA功能的了解,同时为急性髓系白血病的诊断、治疗和预后提供了潜在的生物标志物和靶标。
尹栓[8]（2013）在《WT1基因定量分析在儿童急性白血病MRD检测中的研究》文中认为目的：采用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）方法检测WT1基因在急性白血病患儿外周血和骨髓中的表达,探讨WT1基因在检测微小残留病（minimal residual disease,MRD）中的价值。方法：采用实时荧光定量PCR方法,检测23例初治急性白血病患儿、80例次完全缓解患儿外周血及骨髓中WT1基因的表达水平,以10例非肿瘤患儿为正常对照；流式细胞术检测MRD,并同时观察白血病患儿疾病状态。23例初治急性白血病患儿包括16例急性淋巴细胞白血病（ALL）及7例急性粒细胞白血病（AML）,其中初治ALL组于治疗前、治疗第15天、33天及3个月,初治AML组于治疗前、治疗第15天、1个月、3个月分别采集外周血和骨髓标本,检测WT1表达。80例次完全缓解组患儿（ALL56例次,AML24例次）于治疗第3个月、6个月及12个月分别采集外周血和骨髓检测WT1表达阳性率。结果：1、正常对照组儿童外周血及骨髓WT1表达阳性率均为0,初治白血病组患儿外周血及骨髓WT1表达阳性率均为65.2%,初治白血病组外周血及骨髓WT1的表达均明显高于正常对照组（p=0.001）。ALL和AML外周血WT1表达阳性率比较,骨髓WT1表达阳性率比较,差异均无统计学意义（p=0.533）。完全缓解患儿治疗第3个月、6个月外周血及骨髓WT1表达阳性率明显高于第12个月（p均<0.05）。2、初治ALL患儿治疗前、治疗第15天、33天及3个月外周血WT1表达量分别为0.53±0.14、0.24±0.13、0.18±0.05、0.15±0.11,各组间差异具有统计学意义（F=24.68,p<0.001）；治疗第15天、33天及3个月WT1表达量明显低于治疗前（p均<0.05）,第15天、33天及3个月两两比较,差异均无统计学意义（p>0.05）。初治ALL患儿治疗前、15天、33天及3个月骨髓WT1表达量分别为0.72±0.14、0.16±0.06、0.12±0.02、0.12±0.05,各组间差异具有统计学意义（F=135.27,p<0.001）,治疗第15天、33天及3个月WT1表达量明显低于治疗前（p均<0.05）。治疗第15天、33天及3个月两两比较,差异均无统计学意义（p>0.05）所有初治ALL患儿皆于33天达完全缓解。3、初治AML患儿治疗前、15天、1个月及3个月外周血WT1表达量分别为0.70±0.07、0.20±0.06、0.18±0.05、0.15±0.06,各组间差异具有统计学意义（F=139.29,p<0.001）,治疗第15天、33天及3个月WT1表达量明显低于治疗前（p均<0.05）治疗第15天、33天及3个月两两比较,差异均无统计学意义（p>0.05）。初治AML患儿治疗前、治疗第15天、1个月及3个月患儿骨髓WT1表达量分别为0.87±0.04、0.24±0.05、0.21±0.05、0.18±0.10,各组间差异具有统计学意义（F=241.29,p<0.001）,治疗第15天、33天及3个月WT1表达量明显低于治疗前（p均<0.05）。治疗第15天、33天及3个月两两比较,差异均无统计学意义（p>0.05）。全部初治AML患儿皆于1～2个月内获得完全缓解。4、初治ALL患儿外周血WTl表达量与MRD成正相关,（r=0.999,p<0.001）；初治ALL患儿骨髓WT1表达量与MRD成正相关（r=0.997,p<0.001）。5、3例复发白血病患儿复发前3个月WT1水平上升。结论：1、实时荧光定量PCR方法检测白血病患儿WTl表达简便易行、准确性高、特异性好。2.WT1基因在非肿瘤儿童外周血及骨髓均不表达,而在急性白血病治疗前高表达。3.初治急性白血病患儿诱导缓解化疗后WT1表达水平明显低于初治时。4.WT1阳性率随着治疗时间的延长明显下降。5.ALL患儿外周血及骨髓中WT1表达量与流式细胞仪检测的MRD呈正相关。对急性白血病患儿外周血及骨髓中WT1基因表达进行定量分析,可用于MRD的监测。
祁旬[9]（2012）在《115例急性淋巴细胞白血病免疫表型分析及其临床意义》文中研究说明目的：急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemiaALL）为起源于淋巴祖细胞的恶性克隆性疾病，成人与儿童ALL患者有着显着不同的预后，这与二者生物学特性不同有着很大关系。本实验通过分析并比较成人及儿童初治急性淋巴细胞白血病（ALL）免疫表型，以期为临床诊断，治疗及预后判断提供依据。方法：1对115例初治ALL患者，其中成人62例，儿童53例，利用以CD45/SSC设门的四色流式细胞术（FCM），检测其免疫表型，比较成人ALL及儿童ALL的免疫表型差异。2其中96例ALL患者应用逆转录-巢式聚合酶链反应（RT-PCR）技术进行bcr/abl融合基因的检测，探讨bcr/abl融合基因表达情况与ALL患者免疫表型之间的关系。3采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，应用卡方检验方法比较各细胞表面抗原表达情况的差异性，采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析。结果：1115例ALL患者中，B-ALL94例（81.74%），T-ALL16例（13.91%），T/B混合型5例（4.35%）2T-ALL男性发病率高于女性，B-ALL男女发病率无统计学意义。3B淋标志CD79a在成人，儿童B-ALL患者表达阳性率分别为95.35%，100%，CD19在成人，儿童B-ALL患者表达阳性率分别为93.18%，97.87%；T淋标志CyCD3在成人及儿童T-ALL患者表达阳性率分别为100%，83.33%，CD7在成人及儿童T-ALL患者表达的阳性率分别为70%，100%。CD34、TdT、MPO、CD33、CD15、CD64等髓系标志在成人ALL表达高于儿童ALL，CD13、CD117在成人ALL表达略低于儿童，差异均无统计学意义。4CD10在成人ALL表达阳性率为69.49%（41/59）,低于在儿童表达的阳性率86.67%（39/45），差异有统计学意义（χ2=4.242，P=0.039）。5成人CD34+ALL患者伴髓系抗原表达率为37.21%（16/34）,CD34-患者伴髓系抗原表达率为17.65%（3/17），儿童CD34+者伴髓系抗原表达率为42.86%（12/28）,CD34-者伴髓系抗原表达率为16.67%（2/12），CD34+患者髓系抗原表达率高于CD34-患者，且差异有统计学意义（χ2=4.588，P=0.032）。CD34在T-ALL中仅表达于成人，表达的阳性率为50.00%（5/10），在儿童T淋无一例表达。CD34表达阳性率，在B-ALL高于T-ALL，且差异有统计学意义。成人CD34阴性患者及阳性患者平均无事件生存期分别为11.24个月，5.58个月，成人CD34阴性患者无病生存率明显高于CD34阳性患者（χ2=4.940，P=0.026）。6CD11b表达的阳性率在成人高于儿童，CD11b阳性的患者，要低于于CD11b阴性患者的完全缓解率，差异无统计学意义。CD11b阳性患者发生高白浸润的占其50%（5/10），而CD11b阴性患者发生高白浸润的占7.5%（3/40），显示CD11b阳性ALL患者更容易发生白血病浸润。7CD64+组ALL患者的完全缓解率高于CD64-患者，且差异有统计学意义（P＜0.05）。896例检测bcr/abl融合基因的患者中，bcr/abl融合基因阳性患者共30例，其中B-ALL86.67%（26/30），T-ALL13.33%（4/30），免疫分型多系B细胞来源。bcr/abl融合基因阳性患者，伴髓系抗原表达的患者占其36.67%（11/30）,表达的髓系抗原主要为CD33。bcr/abl融合基因阴性患者，伴髓系抗原表达的占13.64%（9/66）。Bcr/abl融合基因阳性ALL患者伴髓系表达比例显着高于bcr/abl融合基因阴性患者，（χ2=6.633，P=0.010）。9儿童及成人平均无病生存时间分别为25.29个月，7.20个月，儿童ALL患者无事件生存期明显高于成人组（χ2=36.067，P=0.000）。结论：1成人与儿童急性淋巴细胞白血病患者免疫表型存在着一定的差异:CD10在成人ALL患者表达的阳性率低于儿童；CD34+ALL患者髓系抗原表达率高于CD34-组；CD11b表达的阳性率在成人ALL患者高于儿童；Bcr/abl融合基因阳性ALL患者伴髓系表达比例显着高于bcr/abl融合基因阴性患者。2ALL患者免疫表型与临床预后有着一定的关系：CD11b阳性ALL患者更容易发生白血病浸润；成人CD34阴性ALL患者无病生存率明显高于CD34阳性患者; CD64阳性ALL患者的完全缓解率高于CD64阴性ALL患者。3免疫表型之间的差异可能是成人及儿童ALL患者长期预后差异的原因之一。
刘光明[10]（2011）在《六色流式细胞术检测儿童B系急性淋巴细胞白血病相关免疫表型的实验研究》文中进行了进一步梳理背景:B系急性淋巴白血病（B-linage acute lymphocytic leukemia,B-ALL）是表达早期白细胞分化抗原的恶性克隆性疾病,其发病率居儿童恶性肿瘤之首。随着流式细胞术（flow cytometry,FCM）的发展及系列相关单克隆抗体的应用,作为传统的形态学和细胞化学检查的必要补充,免疫分型已成为研究急性淋巴细胞白血病的基本手段之一。由于白血病细胞是肿瘤细胞,会出现与正常细胞表面抗原不同的免疫表型特征,既白血病相关免疫表型（Leukemia associated immunophenotype,LAIP）。LAIP一方面可以成为白血病的诊断依据,另一方面也为今后微小残留病（minimal residual disease, MRD）的监测提供了依据。通过免疫分型不仅可以确定B-ALL的细胞类型和分化阶段,而且依据初诊免疫分型时检查出的LAIP,也成为了MRD检测的重要手段之一。以往B系急性淋巴细胞白血病LAIP的检测主要是利用三色或四色流式细胞术进行。近年来,随着新的荧光标记抗体技术的出现、多色荧光标记抗体的开发和流式细胞仪设备的改进,使利用六色流式细胞术进行LAIP的检测成为可能。本研究在以往我院三色流式细胞术免疫分型的基础上,探讨六色流式细胞技术在B系急性淋巴细胞白血病相关免疫表型检测中的应用。目的:1、探讨广州地区105例B-ALL患儿白血病相关免疫表型体征,为利用六色流式细胞术进行白血病相关免疫表型检测的抗体组合选择提供参考和依据。2、评价六色流式细胞术在B系急性淋巴细胞白血病检测中抗体阳性率的稳定性,探讨六色流式细胞术在B系急性淋巴细胞白血病相关免疫表型检测中的优势,为运用六色流式细胞术进行MRD检测提供参考和依据。方法:1、回顾分析广州市妇女儿童医疗中心2008.8-2010.2收治的105例三色流式细胞术诊断为B-ALL初诊患儿免疫分型结果,以10例非白血病患儿骨髓检测结果为对照。2、利用CD20/CD34/CD10/CD22/CD45/CD19、CD7/CD5/CD13/CD33/CD45/ CD19两组六色抗体组合对25例三色流式细胞术免疫分型诊断为B-ALL的患儿骨髓标本进行六色流式细胞术检测,以10例非白血病患儿骨髓标本检测结果为对照。结果:1、105例患儿中98例可检测出LAIP,LAIP的表达特征为:CD19、CD10、CD34、CD22、HLA-DR过阳性表达率分别为25%、47%、33%、11%、9%;CD45、CD38、HLA-DR弱阳性或缺失表达异常表达率分别为66%、16%、5%;CD34、CD20共阳性跨阶段异常表达率为25%;髓系相关抗原CD13、CD33、CD15、CD64跨系列表达率分别为23%、18%、16%、1%,T系相关抗原CD7跨系列表达率为1%。2、三色流式细胞术免疫分型中CD19、CD22、CD10、CD20、CD5、CD13、CD33、CD34、CD45的阳性检出率分别为96%、100%、76%、40%、4%、36%、36%、84%、36%;六色流式细胞术中CD19、CD22、CD10、CD20、CD5、CD13、CD33、CD34、CD45的阳性检出率分别为100%、96%、80%、40%、4%、44%、32%、84%、40%。三色流式细胞术免疫分型使用23种抗体共检测出CD19strong、CD10strong、CD34strong、CD22strong、CD45-/dim、CD34+/CD38-、CD13+、CD15+、CD33+、CD34+/CD20+ 10种LAIP。25例中23例可检测出LAIP,其中1个LAIP者1例,2个LAIP者4例,3个LAIP者7例,4个LAIP者5例,5个LAIP者5例,6个LAIP者1例。六色流式细胞术使用10种抗体共检测出CD10strong、CD34strong、CD22strong、CD45-/dim、CD19+/CD13+、CD19+/CD33+、CD34+/CD20+、CD34+/CD22++、CD10++/CD20+、19+/CD10++/CD22++、19+/CD34+/CD10dim+、CD 19+/CD45-/dim+/CD34-/dim+、19+/CD10-/CD20-/CD34- 13种LAIP。25例中23例可检测出LAIP,其中1个LAIP者1例,2个LAIP者2例,3个LAIP者4例,4个LAIP者4例,5个LAIP者2例,6个LAIP者5例,7个LAIP者4例,8个LAIP者1例。结论:1、广州地区B-ALL患儿LAIP中抗体的过阳性表达异常以CD10、CD34、CD19多见,比例分别为47%、33%、25%;抗体的弱阳性或缺失表达异常以CD45多见,比例为66%;跨系抗原表达异常中以伴髓系相关抗原CD13、CD33多见,比例分别为23%、18%。2、六色流式细胞术抗体阳性检出率稳定,与三色流式细胞术免疫分型比较各抗体阳性检出率无显着性差异。六色流式细胞术虽所使用的抗体总数较少,但通过FSC/SSC、SSC/CD45、SSC/CD19设门,对幼稚细胞群、CD19+细胞群在多个双参数点图上进行分析,能发现比三色流式细胞术更多的LAIP,并且六色流式细胞术可在同一管中同时检测六种抗原,能根据患儿初诊免疫分型时检测出的LAIP进行灵活调整抗体组合的选择,更有利于运用FCM进行化疗获得形态学缓解后MRD的检测。
二、流式细胞术在探测小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病人中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流式细胞术在探测小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病人中的应用（论文提纲范文）
（1）HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词和中英文对照表 |
| 第一部分 :HIV-1 病毒Nef蛋白抑制剂的筛选和及其作用机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 HIV的研究背景 |
| 1.2 Nef蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 Nef蛋白的基本特征 |
| 1.2.2 Nef介导的HIV病毒躲避免疫监控的机制 |
| 1.3 抗HIV-1药物的研究进展 |
| 1.3.1 抗HIV-1的治疗方法 |
| 1.3.2 抗病毒药物的种类 |
| 1.3.3 开发抗病毒药物的靶标 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.3 实验主要质粒和小分子 |
| 2.1.4 主要试剂耗材 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受试者临床样本入排标准及医学伦理 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 外周血单个核细胞(PBMCs)的分离 |
| 2.2.4 人原代T淋巴细胞的分离培养 |
| 2.2.5 贴壁细胞系的传代 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.7 HEK293T细胞转染实验 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.2.9 单轮感染试验 |
| 2.2.10 病毒体外扩增和感染实验 |
| 2.2.11 自体CD4~+和CD8~+T细胞共培养实验 |
| 2.2.12 细胞毒性杀伤实验 |
| 2.2.13 分子对接 |
| 2.2.14 Western Blot实验 |
| 2.2.14 免疫共沉淀 |
| 2.2.15 蛋白纯化实验 |
| 2.2.16 表面等离子体共振实验 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 高通量筛选Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂,恢复MHC-I的表达 |
| 3.2 洛伐他汀有效抑制Nef介导的MHC-I下调 |
| 3.3 洛伐他汀拮抗Nef介导的CD4和SERINC5 的下调以及抑制病毒颗粒的内源性感染性 |
| 3.4 在野生型HIV-1 感染期间,洛伐他汀可以抑制MHC-I和 CD4 分子的下调 |
| 3.5 洛伐他汀的预处理可增强HIV-1 感染者对重新激活的潜伏库的自体CTL应答 |
| 3.6 洛伐他汀直接作用于Nef,阻断Nef与 AP-1 的相互作用 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 展望 |
| 第6章 结论 |
| 第二部分 :通过整合微小RNA组(mi RNAome)和转录组分析鉴定呼吸道合胞体病毒(RSV)引起的小儿肺炎中mi RNA与 m RNA的互作关系 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 病人样本收集 |
| 2.2 RNA提取实验 |
| 2.3 高通量测序 |
| 2.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 利用高通量测序分析RSV轻症肺炎和RSV重症肺炎患儿全血标本中mi RNA和mRNA差异表达 |
| 3.2 对选定的mi RNA进行验证,鉴定潜在的诊断性mi RNA生物标志物 |
| 3.3 差异表达miRNA靶基因的预测与鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 细胞株来源 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MLL基因重排儿童急性白血病研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）免疫表型与儿童急性髓系白血病临床特征和预后的相关性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 病例资料和方法 |
| 一、研究对象 |
| 二、研究方法 |
| 三、统计学方法 |
| 结果 |
| 一、一般资料 |
| 二、临床疗效分析 |
| 三、生存分析 |
| 四、临床特征分析 |
| 讨论 |
| 免疫表型与临床疗效的分析 |
| 免疫表型与生存预后的分析 |
| 免疫表型相关的临床特征分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略表 |
| 攻读学位期间公开发表的书籍 |
| 致谢 |
（4）GD2008方案治疗298例急性淋巴细胞白血病的长期生存分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 病例与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 急性淋巴细胞白血病的诊断和分型 |
| 3. 化疗方案 |
| 4. 部分定义 |
| 5. 数据收集 |
| 6. 统计方法 |
| 第三章 结果 |
| 1. 分组与生存率 |
| 2. 化疗前基因及染色体检查 |
| 3. 治疗反应评估 |
| 4. 放弃治疗 |
| 5. 复发 |
| 6. 化疗相关并发症 |
| 7. 死亡 |
| 8. 预后分析 |
| 第四章 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 致谢 |
| 在读期间发表文章及参与课题情况 |
（5）CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CX43基因转染人脐血源基质细胞及GJIC功能的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞调节作用的体外研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对小鼠自体造血干细胞移植后残留白血病净化作用的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞因子在急性白血病诊断、治疗、预后中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）采用CCLG-2008方案治疗的儿童急性淋巴细胞性白血病复发因素分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 病例资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（7）人胚胎发育相关微小RNA的鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略对照表 |
| 第一章 微小RNA概述 |
| 1.1 miRNA的转录、加工及特性 |
| 1.2 miRNA的作用机制 |
| 1.3 miRNA的生理功能 |
| 1.4 miRNA的功能研究手段 |
| 1.5 总结 |
| 第二章 miRNA在胚胎发育和肿瘤发生过程中的相关研究进展 |
| 2.1 miRNA在胚胎发育中的研究进展 |
| 2.1.1 阻断miRNA对早期胚胎发育的影响 |
| 2.1.2 miRNA对晚期胚胎发育的影响 |
| 2.1.3 胚胎干细胞中的miRNA及功能研究进展 |
| 2.2 miRNA在肿瘤发生过程中的研究进展 |
| 2.2.1 miRNA的异常表达与肿瘤发生 |
| 2.2.2 miRNA在肿瘤诊断和治疗中的应用 |
| 2.3 胚胎发育与肿瘤发生相关性的纽带-miRNA |
| 第三章 miRNA在造血分化及白血病中的研究进展 |
| 3.1 miRNA在正常造血过程中研究进展 |
| 3.1.1 miRNA与粒系造血分化 |
| 3.1.2 miRNA与单核/巨噬系造血分化 |
| 3.1.3 miRNA与红系和巨核系造血分化 |
| 3.1.4 miRNA与淋巴系造血分化 |
| 3.2 miRNA与急性髓系白血病 |
| 3.3 miRNA与慢性髓系白血病 |
| 3.4 miRNA与淋巴细胞白血病 |
| 3.5 白血病的诊断与治疗的新靶标-miRNA |
| 3.6 总结和展望 |
| 第四章 4-6周龄人胚miRNA表达谱分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 胚胎样本收集 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 胚胎总RNA的提取 |
| 4.3.2 总RNA的定量与质量检测 |
| 4.3.3 miRNA芯片检测与数据分析 |
| 4.3.4 miRNA芯片数据验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人胚4-6周龄的miRNA表达概况 |
| 4.4.2 miRNA芯片数据验证 |
| 4.4.3 人胚胎发育相关miRNA表达聚类分析 |
| 4.4.4 发育同期小鼠与人类胚胎miRNA表达对比分析 |
| 4.4.5 人胚胎发育相关miRNA的保守性分析 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 组织芯片分析人胚胎发育相关miRNA的表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料及试剂 |
| 5.2.1 实验材料和试剂盒 |
| 5.2.2 主要试剂及配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 miRNA的组织芯片原位杂交 |
| 5.3.2 组织芯片数据扫描、读取与分析 |
| 5.3.3 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 miR-638在人各种正常及癌症组织中的表达情况 |
| 5.4.2 miR-720和miR-1280在人各种正常及癌症中的表达 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 miR-638参与髓系造血和急性髓系白血病的发生 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料及仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 主要试剂的配制 |
| 6.2.3 仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 细胞总RNA提取 |
| 6.3.3 miRNA实时荧光定量PCR |
| 6.3.4 外周血和脐带血中分离单个核细胞 |
| 6.3.5 从单个核细胞中分离CD34+细胞 |
| 6.3.6 流式细胞术分析细胞表面分子标志物表达和分选谱系特异性细胞 |
| 6.3.7 髓系白血病细胞体外诱导分化 |
| 6.3.8 瑞氏-吉姆萨染色 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 miR-638表达升高具有髓系特异性 |
| 6.4.2 miR-638在白血病细胞中异常低表达 |
| 6.4.3 miR-638在白血病细胞诱导终末分化中的表达升高 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 miR-638促进PMA和ATRA诱导的白血病细胞系髓系分化 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料及仪器 |
| 7.2.1 实验细胞系 |
| 7.2.2 合成寡核苷酸 |
| 7.2.3 其他试剂 |
| 7.2.4 实验仪器设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 miRNA(或siRNA)转染悬浮细胞 |
| 7.3.2 DNA和RNA的琼脂糖凝胶电泳 |
| 7.3.3 半定量PCR |
| 7.3.4 miRNA和mRNA的实时荧光定量PCR |
| 7.3.5 其他实验方法 |
| 7.4 实验结果 |
| 7.4.1 通过转染合成寡核苷酸调节细胞内的miR-638表达水平 |
| 7.4.2 miR-638促进PMA和ATRA诱导的髓系分化 |
| 7.5 讨论 |
| 第八章 miR-638抑制HL-60细胞增殖及克隆形成能力 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 实验材料及仪器 |
| 8.2.1 实验材料 |
| 8.2.2 克隆及病毒包装载体 |
| 8.2.3 试剂(盒)及酶 |
| 8.2.4 主要试剂及配制 |
| 8.2.5 实验仪器、设备 |
| 8.2.6 生物学软件及数据库 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 人外周血基因组DNA提取和检测 |
| 8.3.2 感受态细胞的制备 |
| 8.3.3 载体的构建 |
| 8.3.4 高纯质粒的提取 |
| 8.3.5 逆转录病毒包装、病毒滴度的检测及细胞感染 |
| 8.3.6 稳转细胞的筛选 |
| 8.3.7 细胞周期分析 |
| 8.3.8 悬浮细胞增殖实验 |
| 8.3.9 软琼脂克隆形成实验 |
| 8.3.10 其他实验方法 |
| 8.4 实验结果 |
| 8.4.1 过表达miR-638对HL-60细胞周期和增殖的影响 |
| 8.4.2 稳转细胞周期、增殖分析 |
| 8.4.3 miR-638抑制HL-60细胞在软琼脂中的克隆形成能力 |
| 8.5 讨论 |
| 第九章 miR-638通过抑制CDK2促进PMA和ATRA诱导的髓系分化 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 实验材料及仪器 |
| 9.2.1 实验材料 |
| 9.2.2 试剂盒、酶和抗体 |
| 9.2.3 主要试剂及配制 |
| 9.2.4 实验仪器、设备 |
| 9.2.5 生物学软件及数据库 |
| 9.3 实验方法 |
| 9.3.1 荧光素酶报告载体的构建 |
| 9.3.2 哺乳动物细胞miRNA和质粒共转染 |
| 9.3.3 双荧光素酶报告实验 |
| 9.3.4 蛋白质免疫印迹 |
| 9.3.5 逆转录病毒介导的稳转细胞构建 |
| 9.3.6 其他实验方法 |
| 9.4 实验结果 |
| 9.4.1 CDK2是miR-638的调控靶标之一 |
| 9.4.2 抑制CDK2的表达促进诱导剂诱导的髓系分化 |
| 9.4.3 CDK2消除miR-638对HL-60克隆形成能力的抑制作用 |
| 9.5 讨论 |
| 第十章 miR-638/CDK2促进原代AML病人白血病细胞体外诱导的髓系分化 |
| 10.1 引言 |
| 10.2 实验材料及仪器 |
| 10.2.1 合成寡核苷酸及转染试剂 |
| 10.2.2 AML病人临床标本 |
| 10.2.3 其他实验材料和试剂 |
| 10.2.4 实验仪器、设备 |
| 10.3 实验方法 |
| 10.3.1 从AML病人来源的临床标本中分离原代细胞 |
| 10.3.2 AML原代细胞的转染及诱导分化 |
| 10.3.3 流式细胞术检测表面标志物表达 |
| 10.3.4 数据分析与统计 |
| 10.4 实验结果 |
| 10.4.1 CDK2蛋白水平在AML病人中表达情况分析 |
| 10.4.2 miR-638/CDK2在诱导剂作用下对AML细胞髓系分化的影响 |
| 10.5 讨论 |
| 研究展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（8）WT1基因定量分析在儿童急性白血病MRD检测中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 WT1定量分析方法 |
| 1.2.1 标本采集与保存 |
| 1.2.2 总RNA的提取 |
| 1.2.3 RNA浓度检测及鉴定 |
| 1.2.4 cDNA的合成 |
| 1.2.5 PCR反应 |
| 1.3 流式细胞仪MRD检测 |
| 1.4 数据处理 |
| 1.5 统计学处理 |
| 第2章 结果 |
| 2.1 荧光定量PCR方法的准确性和特异性检测 |
| 2.1.1 引物特异性检测 |
| 2.1.2 扩增曲线 |
| 2.1.3 溶解曲线 |
| 2.2 急性白血病与正常对照组WT1表达阳性率比较 |
| 2.2.1 急性白血病与正常对照组外周血WT1表达阳性率比较 |
| 2.2.2 急性白血病与正常对照组骨髓WT1表达阳性率比较 |
| 2.3 初治ALL与AML患儿WT1表达阳性率比较 |
| 2.4 完全缓解组WT1表达阳性率比较 |
| 2.4.1 ALL完全缓解患儿治疗不同时间外周血WT1表达阳性率比较 |
| 2.4.2 AML完全缓解患儿治疗不同时间外周血WT1表达阳性率比较 |
| 2.4.3 ALL完全缓解患儿治疗不同时间骨髓WT1表达阳性率比较 |
| 2.4.4 AML完全缓解患儿治疗不同时间骨髓WT1表达阳性率比较 |
| 2.5 初治急性白血病患儿不同时期WT1表达水平比较 |
| 2.5.1 ALL患儿不同时间外周血WT1表达水平比较 |
| 2.5.2 ALL患儿不同时间骨髓WT1表达水平比较 |
| 2.5.3 AML患儿不同时间外周血WT1表达水平比较 |
| 2.5.4 AML患儿不同时间骨髓WT1表达水平比较 |
| 2.6 初治组WT1定量水平与流式细胞术检测MRD相关性 |
| 2.6.1 初治ALL外周血WT1定量水平与流式细胞术检测MRD关系 |
| 2.6.2 初治ALL骨髓WT1定量水平与流式细胞术检测MRD关系 |
| 2.7 急性白血病治疗疗效观察和复发患儿WT1表达 |
| 第3章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）115例急性淋巴细胞白血病免疫表型分析及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 流式细胞学检测急性白血病微小残留 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）六色流式细胞术检测儿童B系急性淋巴细胞白血病相关免疫表型的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 广州地区105例儿童B-ALL白血病相关免疫表型分析 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 试剂仪器 |
| 1.3 抗体标记方法 |
| 1.4 数据采集分析 |
| 1.5 结果 |
| 1.6 讨论 |
| 第二部分 六色流式细胞术用于B-ALL白血病相关免疫表型的检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、流式细胞术在探测小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病人中的应用（论文参考文献）
- [1]HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究[D]. 张旭. 广州医科大学, 2020(01)
- [2]MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究[D]. 孙伊娜. 苏州大学, 2019(06)
- [3]免疫表型与儿童急性髓系白血病临床特征和预后的相关性分析[D]. 刘燕. 苏州大学, 2019(04)
- [4]GD2008方案治疗298例急性淋巴细胞白血病的长期生存分析[D]. 易甜甜. 南方医科大学, 2018(05)
- [5]CX43修饰hUCSCs输注对自体造血干细胞移植后残留白血病的净化效应及机制[D]. 文钦. 第三军医大学, 2017(12)
- [6]采用CCLG-2008方案治疗的儿童急性淋巴细胞性白血病复发因素分析[D]. 袁静. 苏州大学, 2016(01)
- [7]人胚胎发育相关微小RNA的鉴定及功能研究[D]. 林义. 武汉大学, 2014(06)
- [8]WT1基因定量分析在儿童急性白血病MRD检测中的研究[D]. 尹栓. 青岛大学, 2013(S1)
- [9]115例急性淋巴细胞白血病免疫表型分析及其临床意义[D]. 祁旬. 河北医科大学, 2012(01)
- [10]六色流式细胞术检测儿童B系急性淋巴细胞白血病相关免疫表型的实验研究[D]. 刘光明. 广州医学院, 2011(05)
标签：白血病论文; 急性淋巴细胞白血病论文; 流式细胞术论文; 急性髓性白血病论文; 慢性粒细胞白血病论文;