一、亚油酸异构酶及其性质（论文文献综述）
张珂[1]（2018）在《亚油酸异构酶高产菌株的诱变选育及其催化性能的研究》文中研究表明共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）具有抗肿瘤、增强机体免疫力、减肥等多项重要的生理功能。CLA的合成方法主要有化学合成法以及生物合成法。与化学合成法相比,生物合成法特异性强、产物中的活性异构体含量高。而如何获得高产亚油酸异构酶的菌株是生物法生产CLA的基础。本论文以嗜酸乳杆菌作为出发菌株,对其进行ARTP诱变处理,筛选出亚油酸异构酶高产菌株并优化了其产酶条件;研究了突变株的产酶动力学,构建出产酶动力学模型;探讨了影响亚油酸异构酶催化性能的催化体系、反应条件等因素,并对反应条件进行了优化。通过ARTP诱变处理筛选出一株亚油酸异构酶高产菌株B-5,酶活达到964.4 U/m L,是原始菌株的2.26倍。研究了碳源、氮源、碳氮比、培养基初始p H、培养时间、培养温度等因素对产酶的影响,并通过响应面实验对产酶条件进行了优化。最佳碳源为2%的葡萄糖,最佳氮源为2%的牛肉膏,当碳氮比为1:1.5,培养时间为36 h,培养温度为36.4℃,初始p H为5.6时,突变菌株酶活达到1214.1 U/m L,是原始菌株的2.84倍。对突变株产酶动力学进行分析,研究了突变株生长、基质消耗以及亚油酸异构酶合成的动态变化规律。用数学拟合的方法构建了突变株的产酶动力学模型,得到了细胞生长动力学方程、基质消耗动力学方程以及亚油酸异构酶合成动力学方程。使用Origin8.6对其进行非线性拟合,发现这3个方程的预测值和实际观测值误差较小,拟合效果良好,模型能够较好的反映出细胞生长、底物消耗以及亚油酸异构酶积累的变化规律。研究了磷酸盐反应体系、柠檬酸盐反应体系以及醋酸盐反应体系、反应体系p H、反应温度、时间以及底物浓度等因素对亚油酸异构酶转化LA为CLA的影响。通过单因素实验,确定了各因素的最佳水平,并利用响应面软件进行了实验设计,得到最佳反应条件为:底物LA浓度为15 mg/m L、反应温度为37℃、反应体系p H为5.0。在此条件下CLA转化率达到31.86%。
赵黎黎[2]（2017）在《植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶酶学性质及必需基团的研究》文中研究表明共辄亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是一系列具有抗肿瘤、提高免疫力、降血脂、降低胆固醇等功效的含有顺式或反式共轭双键亚油酸的总称。亚油酸异构酶（Linoleic acid isomerase,LAI）是亚油酸（Linoleic acid,LA）生物转化为共辄亚油酸的一个重要酶。植物乳杆菌P-8也有LAI,但其结构和功能及其催化机制不甚清楚。本研究为了探究植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶的酶学性质和一些必需基团,构建了植物乳杆菌P-8LAI的原核表达重组菌BL21-pET28a-LAI。对目的基因IPTG诱导表达条件进行优化,结果表明重组LAI的最佳表达条件是:IPTG终浓度为.0.1mM,130r/min,14h摇床诱导培养。诱导表达的野生型重组LAI经镍柱子纯化后用气相色谱法进行酶学性质分析,结果表明该酶的最适底物浓度是0.3mg/mL,最适温度为37℃,最适酶液体积为100μL,最适 pH 值为 7.0。Km=211.368 g/L,Vmax=75.188 mg/L×h。利用 Specia lized BLAST、http://smart.embl-heidelberg.de/和 vecterNTI 对亚油酸异构酶进行结构分析,锁定可能的6个必需位点,用QuickChange法成功构建了六个点突变体的重组质粒 pET28a-T563C-LAI、pET28a-G320T-LAI、pET28a-A515C-LAI、pET28a-G203C-LAI、pET28a-A389T-LAI和 pET28a-G458T-LAI。诱导表达的6个重组突变LAI,经镍柱子纯化后,用气相色谱法分析其活力并与重组野生型LAI相比较,六个位点的改变均引起酶活力发生大的改变。因此,可以确定LAI的188位、107位、172位、68位、130位和153位的氨基酸残基全为必需基团。
范相振[3]（2016）在《三株乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质分析及转化菜油脚生成共轭亚油酸活力比较和工艺条件的研究》文中研究指明共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是一组具有共轭双键（—C=C—C=C—）的十八碳二烯酸位置与几何异构体混合物的总称。一般认为CLA因其双键的位置及构型共有16种同分异构体,但在这十几种同分异构体中,只有c9,t11-CLA和t10,c12-CLA两种具有生理活性,且与人体及动物营养密切相关。CLA作为一种新型的营养保健品,除了具有很强的抗癌功能外,还具有抑制脂肪沉积、降低胆固醇、防止动脉硬化、改善人体代谢、调节血糖、防治糖尿病、增强免疫力、提高骨骼密度、抗氧化、改善睡眠等作用。CLA的天然来源十分有限,生物法合成CLA是利用微生物亚油酸异构酶（Linoleic acid isomerase,LAI）的作用,转化亚油酸（Linoleic acid,LA）或其衍生物生成CLA的技术,其底物多采用亚油酸、蓖麻油、葵花籽油、玉米胚芽油等一些昂贵的材料,合成成本较高。我国是油菜种植大国,每年菜油的产量多达1000万吨,菜油脚料是提取菜油过程中菜籽油水化脱磷脂的废弃物。按油脚量为菜油的1.5%左右估算,我国每年约有15万吨的菜油脚料产生。菜油脚料残存油脂中含有的亚油酸完全可以在亚油酸异构酶的作用下转化生成极具生理活性的功能性脂肪酸—共轭亚油酸。该技术的应用,将首先解决化学法高温、高压条件下毒副产物的形成问题,提高CLA的产品质量;其次解决传统生物合成法转化率低、生产周期长,成本高、污染大等诸多问题,实现高效率、高品质、低消耗、无污染生产,满足市场对CLA日益增长的需求,同时为农业废弃物—菜油脚料的研究开发提供有力的依据。本文首先对嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854、植物乳杆菌CGMCC1.557和本实验室从泡菜中筛选得到的植物乳杆菌3-9的产酶条件进行了摸索,通过在其MRS培养基中添加不同浓度的LA诱导物诱导其产生亚油酸异构酶,发现这三株菌体对这种诱导物的敏感程度有所不同。当添加的LA浓度为0.1mg/m L时,植物乳杆菌CGMCC1.557和植物乳杆菌3-9诱导产生的亚油酸异构酶活性最强;当添加的LA浓度为0.3mg/mL时,嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854诱导产生的亚油酸异构酶活性最强,由此确定了每种菌产酶培养时诱导物的最佳添加量。随后利用硫酸铵分级沉淀确定了嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854、植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的最佳硫酸铵饱和度范围,其中嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854lai的硫酸铵饱和度下限为30%,上限为80%,植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9lai的硫酸铵饱和度下限为40%,上限为80%。然后通过透析除盐、聚乙二醇浓缩、凝胶过滤层析得到了电泳纯的亚油酸异构酶,实现了对这三种菌亚油酸异构酶的分离纯化。接着比较了这三种乳酸菌亚油酸异构酶的最适反应温度、最适反应ph、酶的热稳定性、酸碱稳定性、以及动力学参数。其中嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶的最适温度为30℃,植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的最适温度均为45℃;三者亚油酸异构酶的最适反应ph均为6.5;嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶受温度影响较为显着,此酶不耐热,而植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9在低温下酶活保持相对稳定,在高温下前者稳定性不如后者;嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶受ph的影响较为显着,其酸碱稳定性最差,植物乳杆菌cgmcc1.557亚油酸异构酶在ph3.06.0之间基本保持稳定,ph高于6.0时,稳定性变差,植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶能适应较宽的ph范围,其酸碱稳定性最优;同时还确定了这三株乳酸菌亚油酸异构酶的动力学参数,嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶的km值为18.99mmol·l-1,vmax为1.58ug·ml-1·min-1;植物乳杆菌1.557亚油酸异构酶的km值为14.83mmol·l-1,vmax为1.75ug·ml-1·min-1;植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的km值为14.26mmol·l-1,vmax为1.94ug·ml-1·min-1。通过比较嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854、植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶在各自最适ph和最适反应温度下转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的大小,确定了植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶转化能力最强,转化生成的共轭亚油酸是植物乳杆菌cgmcc1.557的1.17倍,是嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854的1.72倍。然后比较了嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854、植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶在各自最适ph和最适反应温度下转化菜油脚料生成共轭亚油酸能力的大小,确定了植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶转化能力最强,转化生成的共轭亚油酸是植物乳杆菌cgmcc1.557的1.03倍,是嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854的1.19倍。综合以上结论,选择植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶为转化菜油脚料生成共轭亚油酸的酶类。通过一系列单因素实验,优化了植物乳杆菌3-9酶促菜油脚料生成共轭亚油酸的最佳底物添加量、缓冲液种类、振荡速度、转化时间,然后设计四因素三水平的正交实验,确定了最佳反应条件:底物添加量为3.0m L、缓冲液为磷酸钾缓冲液、振荡速度为100r/min、转化时间为18h,此时酶促菜油脚料生成共轭亚油酸的产量为244.85±4.91ug/m L,是优化前的1.31倍。最后通过研究辅酶因子、金属离子、螯合剂对酶促反应的影响,确定了辅酶因子ATP、ADP、NADH以及金属离子Ca2+、Mg2+对酶的催化活性有一定的促进作用。然后设计了金属离子和辅酶因子的组合实验,探讨了两者的结合对酶促反应的影响,结果表明Ca2+和ATP的结合能很好地促进反应的进行,实现了植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶酶促转化菜油脚料生成共轭亚油酸激活剂的筛选,添加了这二者激活剂后的CLA生成量是未添加的1.27倍。
李晨曦[4]（2016）在《重组亚油酸异构酶在乳酸克鲁维酵母中表达条件的优化及微囊化》文中认为共轭亚油酸具有抗动脉粥样硬化、抗癌、减肥等一系列保健功效,成为近年来的研究热点。亚油酸异构酶是生成共轭亚油酸过程中非常重要的酶。利用天然产酶的微生物或天然的酶催化存在操作过程复杂、不易得到酶,且酶活较低、不稳定的缺点。本试验通过构建乳酸克鲁维酵母工程菌大量的表达重组亚油酸异构酶,并通过微囊化的手段,提高酶活及酶的稳定性,为利用亚油酸异构酶工业化生产共轭亚油酸奠定基础。通过PCR扩增得到植物乳杆菌P-8来源的亚油酸异构酶基因,连接至表达载体pKLAC1上,转化至乳酸克鲁维酵母菌CICC中后,进行优化表达重组亚油酸异构酶,分离发酵液经盐析、Sephadex G-100层析后,制得亚油酸异构酶,经海藻酸钠和聚电解质微囊化后,比较两者的酶活力、热稳定性及酸碱稳定性。经菌落PCR、双酶切鉴定、测序鉴定,成功构建了表达了亚油酸异构酶的酵母基因工程菌。最佳表达条件为：时间4 d,温度25℃,pH为5,培养基碳源为乳糖,接种量为5%,装瓶量90mL （250 mL三角瓶）,摇床转速设定在200r/min,发酵液的酶活为3.43±0.12×103U/mL,发酵液盐析、Sephadex G-100层析后经SDS-PAGE为单一条带,酶活为9.10±0.01×103U/mL。纯化后的亚油酸异构酶制得海藻酸钠微囊和聚电解质微胶囊。海藻酸钠微囊比活力为1.74±0.08×103U/mg,聚电解质微胶囊比活力为2.14±0.10×103U/mg;聚电解质微胶囊酶活较高。海藻酸钠微囊在20～40℃稳定,聚电解质微胶囊在20-50℃稳定。海藻酸钠微囊在pH=4-5稳定,聚电解质微胶囊在pH=4-5稳定。两种微囊的稳定性均有所提高,但聚电解质微囊的效果更好。
柯颖笑[5]（2016）在《瘤胃中乳酸菌亚油酸异构酶基因的克隆表达及多态性分析》文中研究指明共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）通常是指含有顺式或反式共轭双键的一系列构型和位置异构的亚油酸的总称。CLA具有丰富的营养价值,不同的异构体也具有不同的生理功能,如c9,t11-CLA具有抑癌作用,而t10,c12-CLA则能够预防糖尿病和减肥。本研究以从黄牛瘤胃中筛选到的四株具有亚油酸异构酶活性的乳酸菌为出发菌株,通过PCR扩增得到LAI基因后,构建了四株原核工程菌,并利用PCR-RFLP技术对得到的LAI基因进行多态性分析。实验结果如下:1.亚油酸异构酶原核工程菌的构建及表达:本实验室从黄牛瘤胃中分离得到四株具有将LA转化为CLA能力的乳酸菌,通过PCR技术扩增得到LAI基因,PCR产物克隆到pUCm-T质粒中,得到重组质粒（pUCm-T-LAI）,经PCR鉴定、酶切分析和克隆测序鉴定克隆成功后,亚克隆至表达载体pET-DsbA中,构建重组表达载体（pET-DsbA-LAI）并转化到E.coli DH5α中,经PCR鉴定与酶切分析证明重组表达载体（pET-DsbA-LAI）构建成功后,转化到E.coli BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌株表达了大小约为85 kDa的融合蛋白（LAI:64 kDa;DsbA:21kDa）。2.重组菌株的诱导条件优化:对重组菌株诱导表达过程中的诱导剂浓度、诱导时间、诱导时机、诱导温度分别进行了单因素试验,结果发现,BL21（pET-DsbA-206-LAI）重组菌株的最佳诱导条件为:诱导时机选择为培养7 h后进行诱导;诱导时间为15 h;诱导温度为30℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL;BL21（pET-DsbA-Fx-LAI）重组菌株的最佳诱导条件为:诱导时机选择为培养10 h后进行诱导;诱导时间为15 h;诱导温度为25℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL。3.亚油酸异构酶基因的多态性分析:对四株乳酸菌的LAI基因进行多序列比对,结果发现两株植物乳杆菌LAI基因的相似性高达99.5%,两株干酪乳杆菌LAI基因的相似性也高达99.8%。而植物乳杆菌LAI基因与干酪乳杆菌LAI基因的相似性仅为40.9%。用NdeⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ对LAI基因分别进行单酶切发现,植物乳杆菌LAI基因有两个NdeⅠ酶切位点,而干酪乳杆菌LAI基因只有一个NdeⅠ酶切位点;植物乳杆菌LAI基因和干酪乳杆菌LAI基因均只有一个DraⅠ酶切位点;植物乳杆菌LAI基因没有EcoRⅠ酶切位点,而干酪乳杆菌LAI基因却有两个EcoRⅠ酶切位点。两个结果都证明了不同菌株的亚油酸异构酶基因均存在着一定的差异。
范相振,徐尔尼[6]（2016）在《不同乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的比较》文中研究表明对不同乳酸菌菌种中提取出的亚油酸异构酶进行了酶学性质的比较。结果表明,嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854亚油酸异构酶的最适p H为6.5,最适温度为30℃,以亚油酸为底物时酶的米氏常数Km为18.99mmo L·L-1,Vmax为1.58μg·m L-1·min-1;植物乳杆菌CGMCC 1.557亚油酸异构酶的最适p H为6.5,最适温度为45℃,以亚油酸为底物时酶的米氏常数Km为14.83 mmo L·L-1,Vmax为1.75μg·m L-1·min-1;植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的最适p H为6.5,最适温度为45℃,以亚油酸为底物时酶的米氏常数Km为14.26 mmo L·L-1,Vmax为1.94μg·m L-1·min-1。
崔茂林[7]（2016）在《饲料添加剂共轭亚油酸生物合成研究》文中指出共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid,CLA）是一种人体自身无法合成但是具有重要的保健作用和营养价值的一种脂肪酸,近年来利用实验动物对其生理功能做了广泛的研究,包括抗肿瘤、减肥、提高免疫力等生理功能。CLA也是非常有应用前景的饲料添加剂,能够增加动物肌肉组织,减少脂肪含量；生产富含CLA的动物产品如牛奶、禽蛋等；提高动物免疫力,减少抗生素的使用。自然界存在的共轭亚油酸只在反刍动物肉、奶、及其制品中找到,且含量有限。化学生产方法产物不单一,而且混有副产物。因此本实验希望通过生物方法得到一种生物酶,可以在适宜的条件下催化富含亚油酸的红花籽油得到共轭亚油酸,为大规模生产CLA用于饲料添加剂提供基础。本研究共分为以下三个部分：共轭亚油酸检测方法建立。一是分光光度计法,利用共轭亚油酸的共轭双键在233nm下有吸收值,而亚油酸没有；另一种是气相色谱（气质联用）法,根据脂肪酸链的长度和不饱和度进行分离。菌株的构建和发酵条件探索；通过查找蛋白晶体结构,找到了一种来源于痤疮丙酸杆菌的可以生产单一共轭亚油酸（trans-10,cis-12 CLA）的亚油酸异构酶,酶基因由上海捷瑞公司合成,选用大肠杆菌作为转化子,通过构建载体和转化体,获得了一种可以生产单一结构的共轭亚油酸的大肠杆菌。通过亚油酸异构酶的发酵条件研究,确定了发酵底物浓度为1%o LA和1‰辅酶FAD。最适反应温度在40℃左右,pH6.7左右,在此条件下亚油酸异构酶保持最高的活性；双酶联用催化体系的建立和细胞的固定化：以红花籽油作为底物,8种候选脂肪酶与实验二获得的亚油酸异构酶建立双酶联用体系,以共轭亚油酸产率为选择指标,选出2种理想的脂肪酶用于后续反应。通过固定化表达亚油酸异构酶重组细胞,固定化细胞的重复次数达到9次以上,共轭亚油酸的产率达到39%以上,产物的纯度达到99%以上,该技术具有工业应用的前景。
尚继领[8]（2015）在《油脂真菌转化系统及产CLA工程菌株的构建》文中研究指明共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是亚油酸（LA）多种位置和几何异构体的统称,具有抗癌、降脂、增强免疫、抗动脉粥样硬化等重要的生理功能,其中,t10,c12-CLA是最具生理活性的异构体之一。目前工业上主要利用化学异构法生产共轭亚油酸,但产物是多种异构体的混合物,分离纯化困难、成本高。来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）能够将LA转化成单一的t10,c12-CLA。深黄被孢霉、高山被孢霉和拉曼被孢霉经发酵培养后菌丝体能积累大量的游离LA,因此这三株油脂真菌是亚油酸异构酶基因（pai）异源表达潜在的宿主菌株。本研究构建了 pai的异源表达载体,并尝试用农杆菌介导的转化方法将pai导入到三株油脂真菌的基因组上,进而获得能产t10,c12-CLA的工程菌株。本论文的主要研究结果如下:（1）观察了三株油脂真菌的菌落和菌丝形态,并通过气相色谱仪对其发酵培养后的菌丝体内油脂进行分析,结果显示三株菌都能大量积累游离LA。（2）通过敏感性试验没有找到可以作为深黄被孢霉筛选标记的抗生素,但是氯嘧磺隆（500 μg/ml）和潮霉素（500 μg/ml）能分别完全抑制高山被孢霉和拉曼被孢霉孢子的萌发,可以作为筛选两株真菌转化子的筛选标记。（3）以pFGL59为出发质粒,依次连接构巢曲霉启动子PgpdA和终止子Ttrpc,构建了 pLH51。然后将pai连接在启动子和终止子之间,构建了表达载体pLH55。将pFGL820-1上氯嘧磺隆抗性基因替换掉表达载体pLH55上的潮霉素抗性基因,构建了 pai的表达载体pLH107。（4）通过农杆菌介导的转化方法,将质粒pLH107上Ti区域导入到高山被孢霉基因组上。但是转化效率低,通过大量的筛选只获得一株阳性转化子。转化子经发酵培养后菌丝体内没有检测到目标产物t10,c12-CLA。（5）共培养结束后有68.75%的拉曼被孢霉转化子为稳定转化子。温度28℃、时间3 d、农杆菌和孢子比例2:1是拉曼被孢霉和农杆菌最优的共培养条件。转化子经发酵培养后菌丝体内能检测到目标产物t10,c12-CLA,证明pai在拉曼被孢霉中获得表达。
张颜婷[9]（2014）在《聚电解质微囊化重组亚油酸异构酶的制备及活性的研究》文中研究说明共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）是一种具有诸多生理功能的天然脂肪酸,现已被用于食品、保健品。饲料工业等领域,有着较为广阔的应用前景。而亚油酸异构酶（Linoleic Acid Isomerase, LAI）作为共轭亚油酸生物转化的关键酶有着极为重要的研究意义。目前,微生物发酵生产CLA可以获得单一异构体、生产条件较温和、活性异构体高含量,但是在生产过程中微生物发酵也存在不少问题,如底物抑制菌体生长、微生物培养易污染等。生物酶法生产CLA可以解决底物对菌体生长的抑制等问题,且生产条件温和、生产设备简单、对环境无污染。所以,获得高活性、高纯度、高稳定性的LAI是实现CLA量产的必经之路。本研究从基因工程菌JM109-LAI-pQE30中诱导表达重组LAI,经亲和层析得到纯化的重组LAI；为了提高重组LAI的稳定性,随后采用聚电解质层层自组装技术对LAI进行微囊化,并对微囊化LAI进行酶学性质的研究。结论如下：（1）基因工程菌JM109-LAI-pQE30诱导表达重组LAI的最佳条件：诱导时机为培养菌体7h时进行诱导,诱导培养时间为10h,诱导剂浓度为0.15mmM,诱导培养温度为30℃。最佳诱导表达条件下所得LAI粗酶液酶活力为（3.85±0.075）×103U/mL。通过SDS-PAGE电泳检测可得,LAI的相对分子量为64.7kD。（2）经Ni-NTA树脂纯化,纯化后LAI比活力为2.16×103U/mg、酶活力回收率为87%、纯化倍数23.3倍。经SDS-PAGE电泳检测可见较为单一的条带,纯化成功。（3）利用聚电解质层层自组装技术对LAI进行微囊化,所得结论如下：（a）在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下均可见,模板及制备的微囊化LAI呈球状；（b）制备模板的CaCl2:NaC03:LAI的最佳比例为1：1：2；（c）采用4个PAH/PSS双层膜制备的LAI微胶囊比活力最高可达（2.12±0.085）×103U/mg；（d）微囊化LAI最适反应温度50℃、最适反应pH为5,该酶温度在2060℃间、pH为27间能保持稳定,半衰期为95.4h。
王婧波[10]（2014）在《高产共轭亚油酸的菌种诱变选育及酶学特性研究》文中研究指明共轭亚油酸（CLA）,由于其具有抑制肿瘤、降脂、降胆固醇等促进健康的潜在生理功能,受到国内外学者的广泛关注。生产富含CLA的发酵制品,或者制得CLA作为食品添加剂加入食品中,成为食品工业发展的热点。本实验以菌株筛选、人工诱变处理得到高产菌株,及亚油酸异构酶的分离纯化为主要线索,所得实验结果如下：从市购泡菜中筛得能转化生成CLA的菌株,其中以菌株Ips929转化量最大。经紫外波长扫描和Ag+液相色谱分析,发酵产生CLA的量为30.913μg/mL,有两种主要异构体,9c,11t-CLA和10t,12c-CLA。经16s rDNA测定为乳酸杆菌,命名Lactobacillus sp.LL-ZSDS001,对该菌进行了生物学特性研究,发现其最适生长温度为37℃,培养27h,5%菌株接种量时,CLA总产量最大。当底物浓度为1.35mg/mL时,CLA产量和亚油酸转化率最大。以筛得的菌株Lactobacillus sp.LL-ZSDS001为原始菌株,进行铯137-γ射线辐照和N离子束诱变共同处理。其中,铯137-γ射线辐照诱变,当辐照剂量为70Gy时,致死率在88.63%-92.80%之间。筛得1菌株,经5次传代培养后,保持较稳定且较强的产CLA的能力,为52.789μg/mL。对上述菌株进行N离子束诱变处理,处理条件为真空度1×10-3Pa,能量20keV,注入剂量20～140×2.6×1013N+/cm2。得菌体存活率曲线为“马鞍型曲线”,“鞍脊”出现在注入剂量为80、100、120×2.6×1013N+/cm2处。当注入剂量为100、120×2.6×1013N+/cm2时,菌株的正突变率及突变幅度都相对较高。共筛得5株突变幅度高于50%,并有稳定性遗传的菌株,其中以A1转化生成CLA能力最强,达到118.921μg/mL,比原始菌株的54.234μg/mL提高了119.27%。采用硫酸铵分级沉淀、透析浓缩、葡聚糖凝胶G-100层析处理,对Lactobacillus sp.LL-ZSDS001突变株亚油酸异构酶进行分离纯化,经SDS-PAGE电泳分析,该亚油酸异构酶的分子量为69KDa。并对其酶学特性进行初步分析,该异构酶的最适pH值为8.0,最适温度为40℃,微氧环境能提高酶活力。
二、亚油酸异构酶及其性质（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、亚油酸异构酶及其性质（论文提纲范文）
（1）亚油酸异构酶高产菌株的诱变选育及其催化性能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 共轭亚油酸的主要合成方法 |
| 1.2.1 化学合成 |
| 1.2.2 生物合成 |
| 1.3 亚油酸异构酶高产菌株的诱变 |
| 1.4 亚油酸异构酶的研究 |
| 1.5 亚油酸异构酶催化性能的研究 |
| 1.6 选题意义与主要研究内容 |
| 1.6.1 选题意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第2章 ARTP诱变筛选亚油酸异构酶高产菌株 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.2.3 主要药品 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种的活化及LA乳化液的制备 |
| 2.3.2 CLA的检测及异构酶酶活的测定 |
| 2.3.3 产酶培养方法 |
| 2.3.4 粗酶液的制备 |
| 2.3.5 嗜酸乳杆菌生长曲线的绘制 |
| 2.3.6 ARTP诱变处理 |
| 2.3.7 初筛方法的确立 |
| 2.3.8 遗传稳定性实验 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 ARTP诱变致死率曲线 |
| 2.4.2 高产菌株的获得 |
| 2.4.3 突变株的遗传稳定性实验 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 亚油酸异构酶高产菌株的产酶条件优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要药品 |
| 3.2.4 培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌种的活化及LA乳化液的制备 |
| 3.3.2 CLA的检测及亚油酸异构酶酶活的测定 |
| 3.3.3 产酶条件优化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 培养温度对突变株生长和产酶的影响 |
| 3.4.2 培养时间对突变株生长和产酶的影响 |
| 3.4.3 培养基初始pH对突变株生长和产酶的影响 |
| 3.4.4 碳源及其浓度对突变株产酶的影响 |
| 3.4.5 氮源及其浓度对菌株产酶的影响 |
| 3.4.6 碳氮比对突变株生长和产酶的影响 |
| 3.4.7 响应面实验结果 |
| 3.4.8 两因素间的交互作用 |
| 3.4.9 验证实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 亚油酸异构酶突变株产酶动力学研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要药品 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌种的活化及LA乳化液的制备 |
| 4.3.2 CLA的检测及亚油酸异构酶酶活的测定 |
| 4.3.3 突变株B-5菌体生长动力学模型的构建 |
| 4.3.4 突变株B-5产酶过程中基质消耗动力学模型的构建 |
| 4.3.5 突变株B-5产酶过程中产物合成动力学模型的构建 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 突变株B-5菌体生长动力学模型的构建 |
| 4.4.2 突变株B-5产酶过程中基质消耗动力学模型的构建 |
| 4.4.3 突变株B-5产酶过程中产物合成动力学模型的构建 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 亚油酸异构酶催化性能的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 主要仪器和设备 |
| 5.2.3 主要药品 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 LA乳化液的制备 |
| 5.3.2 CLA的检测及亚油酸异构酶酶活的测定 |
| 5.3.3 亚油酸异构酶转化LA为CLA反应体系的选择 |
| 5.3.4 亚油酸异构酶转化共轭亚油酸反应条件的研究 |
| 5.3.5 响应面优化亚油酸异构酶转化共轭亚油酸的反应条件 |
| 5.3.6 验证性实验 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 亚油酸异构酶转化LA为CLA反应体系的选择 |
| 5.4.2 反应温度对CLA催化效率的影响 |
| 5.4.3 底物浓度对CLA催化效率的影响 |
| 5.4.4 保温时间对CLA催化效率的影响 |
| 5.4.5 反应体系pH对CLA催化效率的影响 |
| 5.4.6 响应面实验结果 |
| 5.4.7 两因素间的交互作用 |
| 5.4.8 验证实验 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶酶学性质及必需基团的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 共轭亚油酸的结构 |
| 1.2 共轭亚油酸的功能 |
| 1.3 共轭亚油酸的来源 |
| 1.3.1 共轭亚油酸的天然来源 |
| 1.3.2 共轭亚油酸的化学合成 |
| 1.3.3 共轭亚油酸的内源合成 |
| 1.3.4 共轭亚油酸的微生物合成 |
| 1.4 共轭亚油酸检测方法 |
| 1.4.1 紫外检测法 |
| 1.4.2 银离子高效液相色谱法 |
| 1.4.3 气相色谱法 |
| 1.4.4 气质联用法 |
| 1.4.5 红外光谱检测法 |
| 1.4.6 核磁共振法 |
| 1.5 亚油酸异构酶 |
| 1.5.1 亚油酸异构酶简介 |
| 1.5.2 亚油酸异构酶基因表达的研究进展 |
| 1.5.3 亚油酸异构酶性质的研究 |
| 1.5.4 酶的固定化 |
| 1.5.5 微生物亚油酸异构酶作用机理 |
| 1.6 酶结构功能研究方法 |
| 1.6.1 蛋白晶体学对蛋白结构功能的研究 |
| 1.6.2 核磁共振技术对蛋白结构功能的研究 |
| 1.6.3 拉曼光谱法对蛋白结构功能的研究 |
| 1.6.4 X射线法 |
| 1.6.5 单颗粒冷冻电子显微镜技术 |
| 1.6.6 化学修饰法 |
| 1.6.7 突变法 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 感受态细胞 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物乳杆菌P-8基因组总DNA的提取 |
| 2.2.2 总DNA的检测 |
| 2.2.3 植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶引物设计与PCR扩增 |
| 2.2.4 PCR产物的回收 |
| 2.2.5 目的片段的连接 |
| 2.2.6 pMD-19T- LAI的转化 |
| 2.2.7 阳性克隆的筛选 |
| 2.2.8 重组质粒pMD-19T-LAI的提取 |
| 2.2.9 亚油酸异构酶基因表达载体的构建 |
| 2.2.10 植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶点突变体的构建 |
| 2.2.11 重组目的酶的诱导表达及纯化 |
| 2.2.12 LAI的质谱检测 |
| 2.2.13 目的酶含量的测定 |
| 2.2.14 SDS-PAGE检测酶的大小 |
| 2.2.15 亚油酸异构酶的活力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 植物乳杆菌P-8总DNA的提取 |
| 3.2 LAI的扩增 |
| 3.3 pET-28a(+)质粒的提取 |
| 3.4 重组表达载体的构建 |
| 3.4.1 菌落PCR的鉴定 |
| 3.4.2 重组质粒pET28a-LAI的双酶切鉴定 |
| 3.4.3 重组质粒测序 |
| 3.5 点突变质粒的构建 |
| 3.5.1 点突变质粒的PCR扩增 |
| 3.5.2 点突变质粒的序列比对 |
| 3.6 目的蛋白诱导表达纯化及表达产物的分析 |
| 3.7 目的蛋白的质谱检测 |
| 3.8 突变体蛋白诱导表达纯化及表达产物的分析 |
| 3.9 纯化的LAI及其突变体的浓度测定 |
| 3.9.1 标准曲线绘制 |
| 3.9.2 LAI及其各点突变体蛋白含量的测定 |
| 3.10 标准样品的色谱图 |
| 3.11 LAI酶活力测定 |
| 3.11.1 内标法标准曲线的绘制 |
| 3.11.2 底物浓度与LAI酶促反应速度的影响 |
| 3.11.3 LAI的用量与LAI酶促反应速度的影响 |
| 3.11.4 pH值与LAI酶促反应速度的影响 |
| 3.11.5 温度与LAI酶促反应速度的影响 |
| 3.11.6 金属离子对亚油酸异构酶酶促反应速度的影响 |
| 3.11.7 亚油酸异构酶的动力学参数的确立 |
| 3.11.8 LAI及其各突变体的活力分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒的构建 |
| 4.2 蛋白的表达及纯化 |
| 4.3 酶活性的测定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（3）三株乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质分析及转化菜油脚生成共轭亚油酸活力比较和工艺条件的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 选题依据及意义 |
| 1.2 共轭亚油酸的概述 |
| 1.3 共轭亚油酸的天然来源 |
| 1.4 共轭亚油酸的生理功能 |
| 1.4.1 抗癌作用 |
| 1.4.2 抗动脉粥样硬化 |
| 1.4.3 预防心脑血管疾病 |
| 1.4.4 抗氧化 |
| 1.4.5 增强免疫力 |
| 1.4.6 其他功能 |
| 1.5 共轭亚油酸的人工合成 |
| 1.5.1 化学合成法 |
| 1.5.2 生物合成法 |
| 1.6 亚油酸异构酶的研究进展 |
| 1.7 共轭亚油酸的检测方法 |
| 1.7.1 紫外分光光度法 |
| 1.7.2 红外光谱检测法 |
| 1.7.3 气相色谱法 |
| 1.7.4 银离子高效液相色谱法 |
| 1.7.5 气质联用法 |
| 1.7.6 核磁共振法 |
| 1.8 本课题研究内容及创新点 |
| 1.8.1 研究内容 |
| 1.8.2 技术路线 |
| 1.8.3 创新点 |
| 第2章 三株乳酸菌产亚油酸异构酶的诱导培养 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 嗜酸乳杆菌MRS培养基 |
| 2.1.5 植物乳杆菌MRS培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种活化 |
| 2.2.2 种子培养 |
| 2.2.3 诱导物添加量对三株乳酸菌产亚油酸异构酶的影响 |
| 2.2.4 菌体细胞收集 |
| 2.2.5 粗酶液的制备 |
| 2.2.6 亚油酸乳化液的制备 |
| 2.2.7 酶促反应及酶活的测定 |
| 2.2.8 共轭亚油酸的萃取 |
| 2.2.9 共轭亚油酸标准曲线的绘制 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 共轭亚油酸标准曲线的绘制 |
| 2.3.2 诱导物添加量对三株乳酸菌产亚油酸异构酶的影响 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 三株乳酸菌亚油酸异构酶的分离纯化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 嗜酸乳杆菌MRS培养基（略） |
| 3.1.5 植物乳杆菌MRS培养基（略） |
| 3.1.6 嗜酸乳杆菌（Lactibacillus acidophilus）CGMCC1.1854产酶培养基 |
| 3.1.7 植物乳杆菌（Lactibacillus plantarum）CGMCC1.557产酶培养基 |
| 3.1.8 植物乳杆菌（Lactibacillus plantarum）3-9 产酶培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 考马斯亮蓝法绘制蛋白质标准曲线 |
| 3.2.2 考马斯亮蓝法测定样品蛋白质含量 |
| 3.2.3 菌种活化（略） |
| 3.2.4 种子培养（略） |
| 3.2.5 三株乳酸菌产亚油酸异构酶的诱导培养 |
| 3.2.6 菌体细胞收集（略） |
| 3.2.7 粗酶液的制备（略） |
| 3.2.8 三株菌粗酶液的硫酸铵分级沉淀处理 |
| 3.2.9 三株菌酶液的透析处理 |
| 3.2.10 三株菌酶液的浓缩处理 |
| 3.2.11 三株菌酶液的凝胶过滤层析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 考马斯亮蓝法绘制蛋白质标准曲线 |
| 3.3.2 三株菌粗酶液的硫酸铵分级沉淀处理 |
| 3.3.3 三株菌酶液的凝胶过滤层析 |
| 3.3.4 三株菌亚油酸异构酶的电泳分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 三株乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的分析比较 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 粗酶液的制备（略） |
| 4.2.2 三株菌粗酶液的硫酸铵分级沉淀 |
| 4.2.3 三株菌酶液的透析（略） |
| 4.2.4 三株菌酶液的浓缩（略） |
| 4.2.5 三株菌酶液的凝胶过滤层析 |
| 4.2.6 三株乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的分析比较 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 温度对三株乳酸菌亚油酸异构酶活性的影响 |
| 4.3.2 三株乳酸菌亚油酸异构酶热稳定性的比较 |
| 4.3.3 pH对三株乳酸菌亚油酸异构酶活性的影响 |
| 4.3.4 三株乳酸菌亚油酸异构酶酸碱稳定性的比较 |
| 4.3.5 三株乳酸菌亚油酸异构酶的动力学参数 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 亚油酸异构酶转化菜油脚料生成共轭亚油酸的工艺研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 亚油酸乳化液的制备 |
| 5.2.2 菜油脚料乳化液的制备 |
| 5.2.3 共轭亚油酸的萃取（略） |
| 5.2.4 三株菌酶促亚油酸生成共轭亚油酸活力的比较 |
| 5.2.5 三株菌酶促菜油脚料生成共轭亚油酸活力的比较 |
| 5.2.6 底物添加量对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.2.7 缓冲液种类对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.2.8 转化时间对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.2.9 振荡速度对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.2.10 正交分析优化 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的条件 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 三株菌酶促亚油酸生成共轭亚油酸活力的比较 |
| 5.3.2 三株菌酶促菜油脚料生成共轭亚油酸活力的比较 |
| 5.3.3 底物添加量对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.3.4 缓冲液种类对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.3.5 转化时间对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.3.6 振荡速度对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 5.3.7 正交分析优化 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的条件 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 影响植物乳杆菌 3-9 酶促菜油脚料生成共轭亚油酸因素的研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌种 |
| 6.1.2 主要实验试剂 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 菜油脚料乳化液的制备（略） |
| 6.2.2 共轭亚油酸的萃取（略） |
| 6.2.3 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA体系的建立 |
| 6.2.4 辅酶因子对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 6.2.5 金属离子对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 6.2.6 螯合剂对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 6.2.7 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA激活剂的筛选 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 辅酶因子对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 6.3.2 金属离子对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 6.3.3 螯合剂对 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA的影响 |
| 6.3.4 3-9 菌株的酶促菜油脚料生成CLA激活剂的筛选 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.1.1 三株乳酸菌产亚油酸异构酶的诱导培养 |
| 7.1.2 三株乳酸菌亚油酸异构酶的分离纯化 |
| 7.1.3 三株乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的分析比较 |
| 7.1.4 亚油酸异构酶转化菜油脚料生成共轭亚油酸的工艺研究 |
| 7.1.5 影响植物乳杆菌 3-9 酶促菜油脚料生成共轭亚油酸因素的研究 |
| 7.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（4）重组亚油酸异构酶在乳酸克鲁维酵母中表达条件的优化及微囊化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 共轭亚油酸 |
| 1.2 CLA的天然来源 |
| 1.3 CLA的生成 |
| 1.3.1 内源合成CLA |
| 1.3.2 化学异构法生成CLA |
| 1.3.3 微生物发酵法生成CLA |
| 1.4 植物乳杆菌P-8 |
| 1.5 基因工程菌 |
| 1.5.1 原核系统表达亚油酸异构酶 |
| 1.5.2 真核系统表达亚油酸异构酶 |
| 1.5.3 真核系统表达优势 |
| 1.5.4 乳酸克鲁维酵母 |
| 1.6 亚油酸异构酶酶学性质的研究 |
| 1.6.1 酶的催化专一性 |
| 1.6.2 热对酶活性及稳定性的影响 |
| 1.6.3 pH对酶活性及稳定性的影响 |
| 1.7 酶的稳定性改善 |
| 1.8 研究目的、意义和研究内容 |
| 1.8.1 研究目的、意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 1.9 技术路线 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌和质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 酶和试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 克隆载体的构建 |
| 2.2.2 表达载体的构建 |
| 2.2.3 酵母细胞的转化 |
| 2.2.4 表达条件的优化 |
| 2.2.5 发酵上清液的纯化 |
| 2.2.6 重组亚油酸异构酶酶含量的测定 |
| 2.2.7 重组亚油酸异构酶酶活力测定 |
| 2.2.8 SDS-PAGE检测 |
| 2.2.9 微囊化 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 构建克隆载体 |
| 3.1.1 植物乳杆菌P-8基因组DNA的提取 |
| 3.1.2 亚油酸异构酶基因的PCR |
| 3.1.3 阳性鉴定 |
| 3.1.4 双酶切 |
| 3.2 鉴定转化 |
| 3.2.1 菌落PCR鉴定 |
| 3.2.2 双酶切鉴定 |
| 3.2.3 测序鉴定 |
| 3.3 酵母的生长曲线 |
| 3.4 蛋白标准曲线 |
| 3.5 CLA标准曲线绘制 |
| 3.6 表达条件的优化 |
| 3.6.1 时间对酶活的影响 |
| 3.6.2 温度对酶活的影响 |
| 3.6.3 培养基pH对酶活的影响 |
| 3.6.4 培养基的不同碳源对酶活的影响 |
| 3.6.5 接种量对酶活力的影响 |
| 3.6.6 装瓶量对酶活力的影响 |
| 3.6.7 摇床转速对酶活力的影响 |
| 3.6.8 正交试验结果 |
| 3.6.9 最佳条件表达 |
| 3.7 发酵液的SDS-PAGE检测 |
| 3.8 发酵液的浓缩与纯化 |
| 3.8.1 梯度浓缩 |
| 3.8.2 层析纯化结果 |
| 3.8.3 纯化后的SDS-PAGE |
| 3.8.4 纯化前后酶活力的测定 |
| 3.9 微囊化 |
| 3.9.1 海藻酸钠微囊化 |
| 3.9.2 聚电解质微囊化 |
| 3.9.3 两种方法比较 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）瘤胃中乳酸菌亚油酸异构酶基因的克隆表达及多态性分析（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 CLA的生理功能 |
| 1.2.1 抗癌作用 |
| 1.2.2 抗动脉粥样硬化 |
| 1.2.3 减肥作用 |
| 1.2.4 抗氧化作用 |
| 1.2.5 其他功能 |
| 1.3 CLA的检测方法 |
| 1.3.1 紫外检测法 |
| 1.3.2 气相色谱法 |
| 1.3.3 银离子高效液相色谱法 |
| 1.3.4 气-质联用法 |
| 1.4 亚油酸异构酶的来源 |
| 1.5 亚油酸异构酶的性质 |
| 1.5.1 专一性 |
| 1.5.2 底物对酶的抑制作用 |
| 1.5.3 pH值对酶的影响 |
| 1.5.4 温度对酶的影响 |
| 1.6 亚油酸异构酶基因的序列分析 |
| 1.7 亚油酸异构酶基因表达的研究进展 |
| 1.7.1 原核工程菌的构建与表达 |
| 1.7.2 真核工程菌的构建和表达 |
| 1.8 多态性检测方法 |
| 1.8.1 RFLP（Restriction fragment length polymorphism）法 |
| 1.8.2 RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法 |
| 1.8.3 AFLP（Amplication fragment length polymorphism）法 |
| 1.9 研究内容 |
| 1.9.1 亚油酸异构酶基因原核工程菌的构建 |
| 1.9.2 重组菌株的诱导条件优化 |
| 1.9.3 RFLP法分析亚油酸异构酶基因的多态性 |
| 1.10 研究意义 |
| 第2章 亚油酸异构酶原核工程菌的构建与表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 工具酶 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 实验所用溶液 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.1.7 分析工具 |
| 2.1.8 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌株活化 |
| 2.2.2 亚油酸异构酶基因的克隆 |
| 2.2.3 DH5α和BL21感受态细胞的制备 |
| 2.2.4 克隆载体的构建 |
| 2.2.5 重组质粒（pUCm-T-LAI）转化至DH5α |
| 2.2.6 重组质粒（pUCm-T-LAI）的检测 |
| 2.2.7 重组表达载体的构建 |
| 2.2.8 BL21（pET- DsbA-LAI）重组菌株的诱导表达 |
| 2.2.9 SDS-PAGE检测诱导表达 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物乳杆菌和干酪乳杆菌基因组的提取 |
| 2.3.2 PCR扩增LAI基因 |
| 2.3.3 重组克隆载体的鉴定 |
| 2.3.4 亚油酸异构酶基因序列 |
| 2.3.5 重组表达载体的鉴定 |
| 2.3.6 BL21（pET- DsbA-LAI）重组菌株的诱导表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 重组菌株的诱导条件优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 实验所用溶液 |
| 3.1.5 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组菌株活化 |
| 3.2.2 诱导时机对重组菌株的影响 |
| 3.2.3 诱导剂浓度对重组菌株的影响 |
| 3.2.4 诱导时间对重组菌株的影响 |
| 3.2.5 诱导温度对重组菌株的影响 |
| 3.2.6 乳化油 |
| 3.2.7 粗酶液的制备 |
| 3.2.8 酶活的测定 |
| 3.2.9 CLA的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 诱导时机对重组菌株的影响 |
| 3.3.2 诱导剂浓度对重组菌株的影响 |
| 3.3.3 诱导时间对重组菌株的影响 |
| 3.3.4 诱导温度对重组菌株的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 亚油酸异构酶基因的多态性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 工具酶 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 实验所用溶液 |
| 4.1.6 仪器设备 |
| 4.1.7 分析工具 |
| 4.1.8 引物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株活化 |
| 4.2.2 植物乳杆菌和干酪乳杆菌基因组的提取 |
| 4.2.3 PCR扩增LAI基因 |
| 4.2.4 PCR产物纯化 |
| 4.2.5 基因序列分析 |
| 4.2.6 PCR-RFLP |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PCR扩增LAI基因 |
| 4.3.2 基因序列分析 |
| 4.3.3 PCR-RFLP |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 附录E |
| 附录F |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（6）不同乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的比较（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 种子培养 |
| 1.2.2 产酶诱导培养 |
| 1.2.3 菌体细胞收集 |
| 1.2.4 粗酶液的制备 |
| 1.2.5 盐析 |
| 1.2.6 透析 |
| 1.2.7 浓缩 |
| 1.2.8 凝胶过滤层析 |
| 1.2.9 亚油酸异构酶的电泳分析 |
| 1.2.1 0 亚油酸异构酶底物的乳化处理 |
| 1.2.1 1 酶促反应及酶活的测定 |
| 1.2.1 2 共轭亚油酸的萃取 |
| 1.2.1 3 共轭亚油酸标准曲线的绘制 |
| 1.3 3种乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的分析比较 |
| 1.3.1温度对3种乳酸菌亚油酸异构酶活性的影响 |
| 1.3.2 3种乳酸菌亚油酸异构酶热稳定性的比较 |
| 1.3.3 p H对3种乳酸菌亚油酸异构酶活性的影响 |
| 1.3.4 3种乳酸菌亚油酸异构酶酸碱稳定性的比较 |
| 1.3.5 3种乳酸菌亚油酸异构酶的动力学参数 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 共轭亚油酸标准曲线的绘制 |
| 2.2 亚油酸异构酶的电泳分析 |
| 2.3 温度对3种乳酸菌亚油酸异构酶活性的影响 |
| 2.4 3种乳酸菌亚油酸异构酶热稳定性的比较 |
| 2.5 p H对3种乳酸菌亚油酸异构酶活性的影响 |
| 2.6 3种乳酸菌亚油酸异构酶酸碱稳定性的比较 |
| 2.7 3种乳酸菌亚油酸异构酶酶的动力学参数 |
| 3 结论 |
（7）饲料添加剂共轭亚油酸生物合成研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 共轭亚油酸主要生理功能 |
| 1.2 国内外共轭亚油酸种来源的研究现状 |
| 1.2.1 共轭亚油酸天然食物来源 |
| 1.2.2 化学法制备共轭亚油酸 |
| 1.2.3 CLA的生物合成 |
| 1.3 脂肪酶与亚油酸异构酶双酶体系生产CLA |
| 1.4 固定化酶和固定化细胞 |
| 1.5 本课题的研究内容 |
| 第二章 CLA检测方法建立 |
| 2.0 前言 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 试剂及器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分光光度计检测法检测 |
| 2.2.2 GC-MS法检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 分光光度计法检测 |
| 2.3.2 GC-MS法检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 共轭亚油酸的原核表达系统的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 基因和菌种 |
| 3.2.2 试剂及器材 |
| 3.2.3 溶液与培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 共轭亚油酸异构酶基因的获得 |
| 3.3.2 构建工程菌 |
| 3.3.3 优化重组酶表达的诱导条件 |
| 3.3.4 Ni+柱纯化初步纯化重组蛋白 |
| 3.3.5 重组酶反应最适温度的探索 |
| 3.3.6 重组酶反应最适pH的探索 |
| 3.3.7 在最适反应条件下检测重组酶的转化率和产率 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 优化重组酶表达的诱导条件 |
| 3.4.2 Ni+柱纯化初步纯化重组蛋白 |
| 3.4.3 重组酶反应最适温度的探索 |
| 3.4.4 重组酶反应最适pH的探索 |
| 3.4.5 在最适反应条件下检测重组酶的转化率和产率 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 共轭亚油酸的酶法合成工艺研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 试剂及器材 |
| 4.2.3 溶液与培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组PAI酶液制备 |
| 4.3.2 脂肪酶酶活的测定方法 |
| 4.3.3 脂肪酶CAL-B和共轭亚油酸异构酶PAI的共表达 |
| 4.3.4 筛选脂肪酶,优化反应体系 |
| 4.3.5 固定化PAI酶 |
| 4.3.6 固定化PAI细胞 |
| 4.3.7 双酶联用体系生产共轭亚油酸 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 共表达菌株酶活力的检测 |
| 4.4.2 筛选脂肪酶 |
| 4.4.3 固定化PAI酶 |
| 4.4.4 固定化细胞 |
| 4.4.5 双酶联用体系生产共轭亚油酸 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
（8）油脂真菌转化系统及产CLA工程菌株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA) |
| 1.1.1 共轭亚油酸的结构与性质 |
| 1.1.2 共轭亚油酸的来源 |
| 1.1.3 共轭亚油酸的生理作用 |
| 1.2 亚油酸异构酶 |
| 1.2.1 亚油酸异构酶的种类 |
| 1.2.2 亚油酸异构酶的性质 |
| 1.3 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化体系 |
| 1.3.1 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的特点 |
| 1.3.2 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的影响因素 |
| 1.3.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用 |
| 1.4 本论文的研究意义和内容 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.1.2 工具酶和主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 培养基和主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 霉菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes 1.243)基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 琼脂糖DNA凝胶电泳 |
| 2.2.4 大肠杆菌的化学转化 |
| 2.2.5 三种油脂真菌对不同抗生素的敏感性实验 |
| 2.2.6 重组质粒pFGL59-PgpdA-Ttrpc(pLH51)的构建 |
| 2.2.7 表达质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc(pLH55)的构建 |
| 2.2.8 表达质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc-sulfu (pLH107)的构建 |
| 2.2.9 农杆菌的电转化 |
| 2.2.10 农杆菌介导的拉曼被孢霉和高山被孢霉的转化 |
| 2.2.11 农杆菌介导的拉曼被孢霉转化条件的优化 |
| 2.2.12 拉曼被孢霉RNA的提取与RT-PCR |
| 2.2.13 拉曼被孢霉转化子和野生型菌株的摇瓶发酵 |
| 2.2.14 油脂的提取与检测 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 三株油脂真菌的形态观察及敏感性实验 |
| 3.1.1 三株油脂真菌形态的观察 |
| 3.1.2 三株油脂真菌菌丝体内油脂产量的分析 |
| 3.1.3 三株真菌的敏感性实验 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 高山被孢霉遗传转化系统的构建及pai的异源表达 |
| 3.2.1 表达质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc-sulfu (pLH107)的构建 |
| 3.2.2 农杆菌介导的高山被孢霉的转化 |
| 3.2.3 高山被孢霉转化子菌株摇瓶发酵产物分析 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 拉曼被孢霉遗传转化系统的构建及pai的异源表达 |
| 3.3.1 丝状真菌基因组和痤疮丙酸杆菌基因组的提取 |
| 3.3.2 表达质粒pFGL59-PgpdA-Ttrpc (pLH51)的构建 |
| 3.3.3 表达质粒pFGL59-PgpdA-pai-Ttrpc (pLH55)质粒的构建 |
| 3.3.4 农杆菌介导的拉曼被孢霉的转化 |
| 3.3.5 农杆菌介导的拉曼被孢霉的转化条件优化 |
| 3.3.6 转化子中亚油酸异构酶基因pai转录情况分析 |
| 3.3.7 拉曼被孢霉转化子和野生型菌株摇瓶发酵产物分析 |
| 3.3.8 小结 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（9）聚电解质微囊化重组亚油酸异构酶的制备及活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 共轭亚油酸简介 |
| 1.1.1 共轭亚油酸概述 |
| 1.1.2 共轭亚油酸的来源 |
| 1.1.3 共轭亚油酸的合成 |
| 1.2 亚油酸异构酶研究进展 |
| 1.2.1 亚油酸异构酶概述 |
| 1.2.2 亚油酸异构酶的来源 |
| 1.2.3 亚油酸异构酶的酶学性质 |
| 1.2.4 亚油酸异构酶的催化机理 |
| 1.2.5 亚油酸异构酶的酶活力测定 |
| 1.2.6 亚油酸异构酶的分离纯化 |
| 1.3 固定化酶简介 |
| 1.3.1 酶的固定化方法 |
| 1.3.2 层层自组装聚电解质多层膜 |
| 1.3.3 PAH/PSS聚电解质多层膜 |
| 1.3.4 LAI固定化的研究进展 |
| 1.4 植物乳杆菌P-8研究进展 |
| 1.5 研究的目的、意义和研究内容 |
| 1.6 实验技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 重组菌JM109-LAI-pQE30生长曲线的绘制 |
| 2.2.2 蛋白质含量标准曲线的绘制 |
| 2.2.3 CLA含量标准曲线的绘制 |
| 2.2.4 样品酶活力的测定 |
| 2.2.5 重组菌JM109-LAI-pQE30诱导表达LAI条件的单因素试验 |
| 2.2.6 重组菌JM109-LAI-pQE30诱导表达LAI条件的正交试验 |
| 2.2.7 重组菌JM109-LAI-pQE30诱导表达LAI的SDS-PAGE检测 |
| 2.2.8 Ni-NTA树脂纯化重组LAI |
| 2.2.9 聚电解质微囊化LAI |
| 2.2.10 聚电解质微囊化LAI酶学性质的研究 |
| 2.3 数据处理软件 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组菌JM109-LAI-pQE30生长曲线 |
| 3.2 蛋白质含量标准曲线的绘制 |
| 3.3 CLA含量标准曲线的绘制 |
| 3.4 重组菌JM109-LAI-pQE30诱导表达LAI条件的单因素试验 |
| 3.4.1 最佳诱导时机的确定 |
| 3.4.2 最佳诱导培养时间的确定 |
| 3.4.3 最佳诱导剂浓度的确定 |
| 3.4.4 最佳诱导培养温度的确定 |
| 3.5 重组菌JM109-LAI-pQE30诱导表达LAI条件的正交试验 |
| 3.6 重组菌JM109-LAI-pQE30诱导表达LAI的SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.7 Ni-NTA树脂纯化重组LAI |
| 3.7.1 Ni-NTA树脂纯化重组LAI的SDS-PAGE检测 |
| 3.7.2 Ni-NTA树脂纯化重组LAI的酶活力检测 |
| 3.8 聚电解质层层自组装制各LAI微胶囊的形态 |
| 3.8.1 聚电解质层层自组装制备LAI微胶囊普通光学显微镜下的形态 |
| 3.8.2 聚电解质层层自组装制备LAI微胶囊激光共聚焦显微镜下的形态 |
| 3.9 LAI固载率的测定 |
| 3.10 聚电解质包覆层数对LAI微胶囊酶活力的影响 |
| 3.11 聚电解质包覆层数对LAI微胶囊微粒直径的影响 |
| 3.12 酶学性质的研究 |
| 3.12.1 LAI最适反应温度的测定 |
| 3.12.2 LAI热稳定性的测定 |
| 3.12.3 LAI最适反应pH的测定 |
| 3.12.4 LAI酸碱稳定性的测定 |
| 3.12.5 LAI半衰期的测定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）高产共轭亚油酸的菌种诱变选育及酶学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 共轭亚油酸的结构与功能 |
| 1.2 共轭亚油酸的来源 |
| 1.2.1 化学合成 |
| 1.2.2 生物合成 |
| 1.2.2.1 双歧杆菌 |
| 1.2.2.2 乳酸杆菌 |
| 1.2.2.3 丙酸杆菌 |
| 1.2.3 亚油酸对菌体生长的抑制作用 |
| 1.3 共轭亚油酸的分析检测 |
| 1.3.1 紫外检测法(UV) |
| 1.3.2 气相色谱法(GC) |
| 1.3.3 高效液相色谱法 |
| 1.3.4 气-质联用(GC-MS) |
| 1.4 微生物离子注入诱变技术 |
| 1.5 亚油酸异构酶的研究进展 |
| 1.5.1 亚油酸异构酶的分布 |
| 1.5.2 亚油酸异构酶的分离纯化 |
| 1.5.3 亚油酸异构酶的性质 |
| 1.5.3.1 底物与产物的专一性 |
| 1.5.3.2 最佳反应温度 |
| 1.5.3.3 最佳反应pH值 |
| 1.5.3.4 其它因素对酶活的影响 |
| 1.5.4 亚油酸异构酶作用机理 |
| 1.6 选题的内容及意义 |
| 1.6.1 选题的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第2章 共轭亚油酸高产菌株的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.1.3.1 菌种分离 |
| 2.1.3.2 发酵方法 |
| 2.1.3.3 待测样品的提取 |
| 2.1.3.4 CLA的检测方法 |
| 2.1.3.4.1 CLA含量标准曲线的绘制 |
| 2.1.3.4.2 紫外分光光度计检测 |
| 2.1.3.4.3 高效液相色谱Ag~+-HPLC检测 |
| 2.1.3.5 16s rDNA菌种鉴定 |
| 2.1.3.5.1 菌株基因组DNA提取 |
| 2.1.3.5.2 PCR扩增 |
| 2.1.3.6 CLA高产菌株的生理学特性研究 |
| 2.1.3.6.1 培养温度对CLA产量的影响 |
| 2.1.3.6.2 培养时间对CLA产量的影响 |
| 2.1.3.6.3 亚油酸添加量对CLA产量的影响 |
| 2.1.3.6.4 接种量对CLA产量的影响 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 产CLA菌株的筛选 |
| 2.2.1.1 CLA紫外吸收标准曲线 |
| 2.2.1.2 菌株筛选 |
| 2.2.1.3 Ag~+-HPLC检测生成的CLA |
| 2.2.2 菌种鉴定 |
| 2.2.2.1 菌株的菌落和形态特征 |
| 2.2.2.2 16s rDNA菌种鉴定 |
| 2.2.2.3 菌株16s rDNA序列测定及比对 |
| 2.2.3 诱变高产菌株培养条件的优化 |
| 2.2.3.1 最佳培养温度的确定 |
| 2.2.3.2 最佳培养时间的确定 |
| 2.2.3.3 LA添加量对CLA产量的影响 |
| 2.2.3.4 接种量对CLA产量的影响 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.3 结论 |
| 第3章 N~+精确定位选育高产CLA乳酸菌 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 菌株活化 |
| 3.1.6 高产菌种的诱变选育 |
| 3.1.6.1 菌种生长曲线的测定与绘制 |
| 3.1.6.2 铯137-γ射线辐照诱变 |
| 3.1.6.3 N离子束诱变选育 |
| 3.1.6.3.1 菌膜的制备 |
| 3.1.6.3.2 N离子束诱变条件 |
| 3.1.6.3.3 存活率和突变率的计数 |
| 3.1.7 菌株计数和发酵方法 |
| 3.1.7.1 菌种计数 |
| 3.1.7.2 发酵方法 |
| 3.1.8 CLA的提取与检测 |
| 3.1.8.1 CLA的提取 |
| 3.1.8.2 CLA的含量测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 铯137-γ射线辐照诱变 |
| 3.2.1.1 辐照剂量的选择 |
| 3.2.1.2 诱变菌株发酵情况 |
| 3.2.1.3 高产突变菌株产CLA的稳定性 |
| 3.2.2 离子束注入诱变 |
| 3.2.2.1 离子注入剂量对菌体存活率的影响 |
| 3.2.2.2 离子注入剂量对菌株突变率的影响 |
| 3.2.2.3 高产突变菌株产CLA的稳定性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 亚油酸异构酶的分离与纯化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 试剂与填料 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.1.4.1 菌种的活化 |
| 4.1.4.2 产酶诱导培养 |
| 4.1.4.3 菌体收集 |
| 4.1.4.4 饱和硫酸铵分段盐析 |
| 4.1.4.5 酶液的透析与浓缩 |
| 4.1.4.6 葡聚糖凝胶G-100层析 |
| 4.1.4.7 蛋白质浓度的测定 |
| 4.1.4.8 酶活的测定 |
| 4.1.4.9 酶活相应计算方法 |
| 4.1.4.10 SDS-PAGE电泳分析 |
| 4.1.6 亚油酸异构酶理化性质的研究 |
| 4.1.6.1 温度对亚油酸异构酶活性的影响 |
| 4.1.6.2 反应时间对亚油酸异构酶活力的影响 |
| 4.1.6.3 pH值对亚油酸异构酶的影响 |
| 4.1.6.4 微氧条件对亚油酸异构酶活力的影响 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 蛋白质标准曲线的绘制 |
| 4.2.2 硫酸铵分级沉淀 |
| 4.2.3 葡聚糖凝胶G-100过滤层析 |
| 4.2.4 分离纯化后酶活力的变化 |
| 4.2.5 亚油酸异构酶分子量测定 |
| 4.2.7 亚油酸异构酶的酶学性质 |
| 4.2.7.1 亚油酸异构酶对温度的耐受性 |
| 4.2.7.2 反应时间对亚油酸异构酶活力的影响 |
| 4.2.7.3 pH值对亚油酸异构酶活力的影响 |
| 4.2.7.4 微氧条件对亚油酸异构酶活力的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 全文结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
四、亚油酸异构酶及其性质（论文参考文献）
- [1]亚油酸异构酶高产菌株的诱变选育及其催化性能的研究[D]. 张珂. 安徽工程大学, 2018(01)
- [2]植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶酶学性质及必需基团的研究[D]. 赵黎黎. 内蒙古农业大学, 2017(12)
- [3]三株乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质分析及转化菜油脚生成共轭亚油酸活力比较和工艺条件的研究[D]. 范相振. 南昌大学, 2016(03)
- [4]重组亚油酸异构酶在乳酸克鲁维酵母中表达条件的优化及微囊化[D]. 李晨曦. 内蒙古农业大学, 2016(02)
- [5]瘤胃中乳酸菌亚油酸异构酶基因的克隆表达及多态性分析[D]. 柯颖笑. 南昌大学, 2016(03)
- [6]不同乳酸菌亚油酸异构酶酶学性质的比较[J]. 范相振,徐尔尼. 安徽农业大学学报, 2016(02)
- [7]饲料添加剂共轭亚油酸生物合成研究[D]. 崔茂林. 杭州师范大学, 2016(08)
- [8]油脂真菌转化系统及产CLA工程菌株的构建[D]. 尚继领. 天津科技大学, 2015(04)
- [9]聚电解质微囊化重组亚油酸异构酶的制备及活性的研究[D]. 张颜婷. 内蒙古农业大学, 2014(01)
- [10]高产共轭亚油酸的菌种诱变选育及酶学特性研究[D]. 王婧波. 浙江工商大学, 2014(08)