一、糖基磷脂酰肌醇锚定型小鼠B7.1融合蛋白的制备及抗肿瘤作用研究（论文文献综述）
陈琛[1]（2020）在《表达非洲猪瘟病毒蛋白的重组酿酒酵母的构建及免疫效力评价》文中认为非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的高度接触性传染病,可引起猪高死亡率及慢性持续性感染。目前我国的ASFV流行株为p72基因II型,CD2v 8型,呈现多省区多点爆发的流行态势。ASFV病毒粒子结构、致病及免疫机制具有特殊性,预示了疫苗研制面临极大的挑战。本文应用酿酒酵母为载体表达多种ASFV蛋白,探索了通过口服防控ASFV感染的可能性。本课题的主要研究结果如下:（1）重组酿酒酵母表达的ASFV基因的筛选:分析ASFV病毒粒子结构、病毒结构蛋白的免疫原性、结构与功能,结合已有相关疫苗研究,筛选并合成了一批在病毒感染增殖过程中发挥重要作用的的基因,以期作为重组酵母设计中的候选基因。（2）ASFV多基因酿酒酵母表达载体的设计与构建:设计构建了三类酿酒酵母表达载体,分别为ASFV多基因串联表达型（第1类）、ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型（第2类）以及ASFV蛋白膜锚定与分泌双表达型（第3类）。应用Yeast Fab模块体外组装方法构建了GPD启动子控制的Aga2-ASFV蛋白编码基因转录单位（GPD-Aga2-ASFV genes-ADH1）,连同同源重组模块URR1、URR2,营养缺陷筛选模块LEU2,根据大片段末端互补配对原则,通过单管法实现基因组大片段体外的顺序连接组装,将单管反应片段经醋酸锂（LiAc）转化酿酒酵母ST1814G（或者ST1814G/TEV、ST1814G/R3C菌株）,利用酵母细胞片段拼接修复、同源重组机制,实现了将Aga2-ASFV蛋白表达元件稳定整合至ST1814G（或者ST1814G/TEV、ST1814G/R3C）IV染色体HO基因座（URR1-HIS3-URR2）的目标,通过SD-LEU选择性培养基培养筛选和PCR鉴定初筛阳性重组子,获得表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母。另外,构建了酵母高尔基体膜锚定表达TEV水解酶（TEV）、鼻病毒3C蛋白酶（R3C）的酵母底盘菌株;分别构建完成了3类表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母,P72-A104R-CP312R-P12、CD2v-EP153R-EP152R-P17、PP62-P22（第1类）,P30-γFc、P54-αFc（第2类）,P30-F2A、CD2v-F2A、E248R-F2A、E120R-F2A（第3类）,共获得表达14种ASFV蛋白的10株重组酵母菌株。（3）三类表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母的表达特征研究:利用Western blot、免疫荧光、流式细胞术分析了ASFV蛋白在酿酒酵母细胞中的表达及表面展示特征;发酵动力学分析表明ASFV蛋白的表达会在一定程度上影响重组酵母的生长。（4）ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型重组酿酒酵母的免疫效力评价:应用猪小肠上皮细胞系IPEC-J2和巨噬细胞3D4/21对P30-γFc、P54-αFc融合表达重组酵母菌株的共培养实验评价了不同Ig重链、Fc受体表达细胞对重组酵母粘附、吞噬内化的影响,结果表明,Fc融合表达可促进猪源细胞对表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母的结合与内吞,有助于抗原的提呈加工。表达纯化了ASFV原核重组蛋白P30、P54和K145R,通过间接ELISA检测了重组酵母发酵液口服免疫猪血清中抗体的动力学变化,结果表明重组酵母口服免疫猪血清中ASFV蛋白P30、P54特异性Ig G和Ig A抗体水平显着高于未免疫组。综上所述,本研究基于酿酒酵母菌株建立了一个新的技术平台,完成单菌株多价、多模态表达外源蛋白载体的构建,大片段的组装,以及重组子的筛选、表达鉴定等;获得了表达ASFV主要免疫原蛋白的重组酿酒酵母菌株,并初步探究了其表达特征,评价了ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型重组酿酒酵母口服免疫的免疫效力,为ASFV的防控提供了新手段。
杨春华[2]（2019）在《双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分构建双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒目的:构建双调控并荷载精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,SPAG9）短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9并验证调控SPAG9蛋白表达的效果。方法:1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒p DD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒p BHGE3（含有腺病毒右臂序列）通过Lipofectamine TM2000共转染至HEK-293细胞内,包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9。2.琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒,通过Cs Cl密度梯度离心法纯化,半数组织细胞感染剂量（Tissue culture infective dose,TCID50）法测定滴度。3.通过Western Blot检测DD3-ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞SPAG9基因的沉默效果。结果:1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,经扩增纯化后,DD3-ZD55-SPAG9的病毒滴度为9.46×10^8 pfu/ml。2.Western Blot结果显示DD3-ZD55-SPAG9可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9蛋白的表达,与对照组相比,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论:成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,并可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9基因的表达第二部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛（Docetaxel,DTX）在体外对去势抵抗性前列腺癌的治疗效果。方法:1.结晶紫染色和CCK-8观察各组对前列腺癌PC-3和DU145与正常前列腺细胞WPMY-1细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组对PC-3和DU145细胞迁移侵袭能力的抑制。3.Hoechst-33258染色实验检测各组PC-3和DU145细胞的凋亡。4.Western Blot实验检测PC-3和DU145细胞内SPAG9,侵袭和凋亡相关蛋白的表达。结果:1.结晶紫染色结果:各病毒治疗组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性,DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性,各组处理48小时后,高浓度的DTX（>4ng/ml）,高滴度的ZD55-SPAG9（MOI>20）会对WPMY-1细胞产生毒性作用,而DD3-ZD55-SPAG9在MOI>50时才会对WPMY-1细胞产生毒性作用,提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更高的安全性。2.CCK-8结果:随病毒和药物作用时间的延长,对前列腺癌细胞的增殖抑制效果均逐渐增强,且随病毒滴度和药物浓度的升高,对细胞的增殖抑制效果也逐渐增强。感染48小时后,联合组对前列腺癌细胞的增殖抑制效果明显高于各单一治疗组。各处理组48小时后WPMY-1细胞增殖较对照组无明显差异。3.划痕实验结果:24小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组,且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组。4.Transwell实验结果:48小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组,联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组。5.Hoechst-33258染色结果:48小时后,各治疗组的细胞凋亡率均高于PBS组,且联合组细胞凋亡率明显高于单一组。6.Western Blot实验结果显示:各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组,侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组,Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。联合组内SPAG9,Vimentin,MMP-2的表达量明显低于单治疗组,同时E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组。结论DD3-ZD55-SPAG9可以在体外有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并可以有效诱导PC-3和DU145凋亡,效果略低于ZD55-SPAG9,但对WPMY-1细胞具有更高的安全性。对前列腺癌细胞侵袭能力的抑制作用,其机制之一可能是沉默SPAG9基因表达后,通过调控与上皮细胞间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关蛋白,上调E-cadherin,下调Vimentin,MMP-2的表达有关。对前列腺癌细胞凋亡诱导机制可能是通过促进caspase8与caspase3介导的内源性凋亡实现,联合使用多西他赛可起协同作用,增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。第三部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛对裸鼠移植瘤的治疗效果。方法:1.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型。监测不同处理组对移植瘤的生长的影响。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组肿瘤的生长状况。2.原位末端缺口标记法（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。3.免疫组化和Western Blot检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。结果:1.成功构建裸鼠移植瘤,各治疗组肿瘤生长速度均低于对照组,HE结果显示各治疗组内均存在肿瘤细胞凋亡坏死,联合组更为明显。2.TUNEL结果显示各治疗组内均存在明显的肿瘤细胞凋亡,联合治疗组较单一治疗组凋亡现象更为明显。3.免疫组化和Western Blot结果显示各治疗组内SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增多,联合组对上述蛋白的表达调控更为显着。结论:DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,并促进移植瘤细胞凋亡,抑制SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达,促进E-cadherin蛋白表达。但效果略低于ZD55-SPAG9。联合使用多西他赛后可以获得较单一治疗更高的移植瘤治疗效果。
葛蕙心,张一兵,李慧忠,畅继武[3]（2016）在《GPI-B7-1锚定肾癌细胞膜对细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤的促进作用》文中进行了进一步梳理目的探讨糖基磷脂酰肌醇（GPI）-B7-1锚定肾细胞癌（RCC）细胞膜能否提高细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对自身肿瘤的杀伤能力。方法取出本实验室冻存于液氮罐中的经转基因高表达GPI-B7-1的CHO/DHFR-细胞,再从该CHO/DHFR-细胞上洗脱目的蛋白GPI-B7-1,并进行分离纯化,Western blotting法检测活性。建立肾癌细胞系CG-6327。将CTL分别与GPI-B7-1-CG-6327细胞膜、CG-6327细胞膜、GPI-B7-1-CHO/DHFR-细胞膜作用24 h,此时得到被三种不同物质活化的CTL细胞,再设单纯体外培养的CTL作为对照,分别将上述四种CTL细胞加入到已接种有CG-6327细胞的96孔板中,进行24 h杀伤试验,MTT法测定CTL的杀伤活性。结果经GPI-B7-1-CG-6327细胞膜活化的CTL细胞杀伤活性（A值）与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其他几种物质活化的CTL细胞杀伤活性与对照组比较,P均>0.05。结论通过基因重组方法表达的GPI-B7-1锚定蛋白可被转移并锚定在RCC细胞膜表面提供第二刺激信号,GPI-B7-1锚定后的具有双刺激信号的RCC细胞膜对于CTL的活化有增强作用。
徐亚琨,易平勇,谢宇,江勃年[4]（2012）在《mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗的抗肿瘤作用研究》文中认为目的制备mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗,并探讨其抗肿瘤作用。方法将mB7.1-GPI融合蛋白锚定于小鼠结肠癌细胞膜上,制备结肠癌细胞疫苗,并采用流式细胞术检测该蛋白的细胞膜锚定效果;建立C57BL/6小鼠结肠癌模型,检测mB7.1-GPI融合蛋白肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果 mB7.1-GPI融合蛋白可锚定在小鼠结肠癌细胞膜上,并有效刺激小鼠脾细胞增殖和分泌IL-2和IFN-γ,mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗能够显着抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并延长其生存期。结论 mB7.1-GPI融合蛋白制备的结肠癌细胞疫苗具有较强的抗肿瘤作用,可能成为一种有效的、用于结肠癌的治疗和预防的新型疫苗。
黄侃[5]（2011）在《磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达以及单抗的筛选和制备》文中提出原发性肝癌（HCC）是一种世界范围内的高发性癌症,是肝细胞或者肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤,具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、易转移的特点。是全球第三位、我国第二位的癌症死因,且发病率有逐年上升的趋势。是严重威胁我国人民身体健康的恶性肿瘤,亟待针对肝癌新的诊断和治疗方面的研究。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复杂糖蛋白复合物,广泛表达于细胞表面,通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜表面,能和多种细胞外生长因子结合,在机体的发育中具有重要的作用。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3与肝癌发生、发展有着密切的关系,并且在HCC中特异性高表达,是检测原发性肝癌的重要血清学标志和治疗的候选靶标。制备GPC3的高效特异抗体,对更好地探寻GPC3在肝癌发生,发展中的作用,建立灵敏准确的诊断肝癌的方法,以及拓展对肝癌治疗的研究,有重要的意义。本论文主要分为以下三个部分：一、构建用于原核表达GPC3 C端序列的大肠杆菌工程菌并诱导表达采用基因工程方法,构建GPC3 C端序列的表达载体,转入大肠杆菌工程菌后,获得了表达GPC3 C端序列的工程菌株BL21-pET32-GPC3、BL21-pIGH3-GPC3。通过IPTG化学诱导表达,成功使得工程BL21-pET32-GPC3、BL21-pIGH3-GPC3表达融合蛋白Trx-GPC3和pIGH3-GPC3,并通过肠激酶切,成功获得GPC3蛋白的C端部分。二、单克隆瘤细胞的制备以纯化的GPC3 C端蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取血清效价最高的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合；通过HAT选择性培养基筛选,获得杂交瘤细胞,再经有限稀释法筛选,获得能大量分泌特异性抗GPC3抗体的杂交瘤细胞株GPC3-9、GPC3-11；将细胞株GPC3-9、GPC3-11接种至健康BALB/c小鼠腹腔,大量制备腹水型单抗,并对其进行抗体亲和力测定,分别K=1.668×109mol/L±0.188, K=1.668×109mol/L±0.188;通过细胞ELISA,细胞蛋白Western Blot证实,单克隆抗体GPC3-9、GPC3-11可以特异性结合肝癌细胞HepG2中的GPC3蛋白。三、利用噬菌体抗体库中筛选噬菌体单克隆抗体利用原核表达的GPC3在人源噬菌体抗体库Tomilison I+J中筛选,得到抗GPC3的四株噬菌体抗体。本论文通过基因工程技术,构建了表达GPC3 C端序列的载体,在大肠杆菌中诱导表达了重组GPC3 C端蛋白,并作为抗原筛选建立了分泌特异性结合GPC3抗体的鼠单克隆瘤细胞系,同时在人源噬菌体抗体库中进行筛选。期望能得到特异性抗GPC3的高亲和力抗体,以应用于诊断,治疗原发性肝癌的研究工作。
朱广,肖高明,王文祥,易平勇[6]（2010）在《mB7-1-GPI融合蛋白锚定Lewis细胞疫苗的制备及抗肿瘤作用》文中研究表明目的将mB7-1-GPI融合蛋白锚定于小鼠肺癌细胞株（Lewis）膜上,制备肿瘤细胞疫苗,研究该瘤苗的抗肿瘤作用。方法将mB7-1-GPI融合蛋白锚定于小鼠肺癌细胞（Lewis）膜上,制备肿瘤细胞疫苗。采用流式细胞术检测该蛋白的细胞膜锚定作用。建立C57BL小鼠的肺癌模型,观察用mB7-1-GPI融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。结果 mB7-1-GPI与Lewis瘤细胞共同孵育4 h后4℃放置0、4 h和8 h,样本的荧光强度分别为11.2、10.6和9.8,阳性细胞数百分率分别为95.8%、93.6%、91.1%。脾细胞+Lewis组IL-2和IFN-γ分泌量分别为（25.9±1.4）pg/ml、（56.0±3.5）pg/ml,脾细胞+Lewis/mB7-1-GPI组IL-2和IFN-γ分泌量分别为（871.3±10.4）pg/ml和（1329.0±11.9）pg/ml,25 d时,Lewis/mB7-1-GPI瘤苗组小鼠的肿瘤直径（1.4±0.21）cm较Lewis瘤苗治疗组小（2.5±0.27）cm,差异有统计学意义（P<0.05）。Lewis/mB7-1-GPI瘤苗组小鼠寿命为（75.2±2.0）d,与Lewis瘤苗组（40.2±1.3）d相比,生存期延长,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 mB7-1-GPI融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有较强的抗肿瘤作用,有可能作为一种有效的新型疫苗用于肿瘤的治疗和预防。
郭荫广[7]（2010）在《肿瘤特异性锚定型α-gal模拟表位真核表达质粒的构建及功能研究》文中研究表明目的:为了将肺癌的靶向基因治疗和自体免疫增强疗法相结合,本研究扩增α-gal模拟表位序列和GPI锚定序列的融合基因,构建Survivin启动子调控的gal-GPI融合基因的真核表达质粒pSGFP-gal-GPI,并在细胞水平上研究重组质粒的表达功能以及血清天然anti-gal IgG与肺癌细胞表面特异性锚定表达的α-gal模拟表位的结合而介导的特异性杀瘤效应,为探索肺癌及其它肿瘤的基因治疗途径奠定基础。方法:1.分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243bp GPI锚定序列,双酶切后定向克隆入pSGFP质粒中,构建并鉴定pSGFP -GPI真核表达质粒。经脂质体介导转染A549细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP-GPI融合蛋白在真核细胞内的表达及分布。2.PCR法扩增gal-GPI融合基因,以pSGFP质粒为载体,构建Survivin启动子调控的pSGFP-gal-GPI真核表达质粒。通过酶切及测序鉴定后,用脂质体将该质粒转染A549细胞,72h后提取总RNA,通过RT-PCR鉴定重组质粒在A549细胞中的转录水平。3.将pSGFP-gal-GPI用脂质体瞬时转染A549细胞后,用荧光显微镜观察GPI锚定表达功能,用免疫组化法和Western-blot法对锚定表达的α-gal模拟表位进行定位和免疫反应性分析,并用新鲜人血清对表达α-gal模拟表位的A549细胞进行补体介导的溶细胞效应研究。结果:1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSGFP-GPI真核表达质粒构建成功;将重组质粒及pSGFP分别转染A549细胞48h后,荧光显微镜观察pSGFP-GPI质粒转染A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光,而对照pSGFP质粒转染A549细胞仅见胞内均匀荧光。2.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSGFP-gal-GPI真核表达质粒构建成功。质粒转染A549细胞后,RT-PCR结果表明,pSGFP-gal-GPI质粒在A549细胞中成功转录了gal-GPI目的基因。3.pSGFP-gal-GPI质粒转染细胞的绿色荧光不均匀分布在细胞膜周围,免疫细胞化学分析表明重组融合蛋白表达在细胞膜上,Western-blot结果表明重组融合蛋白与人IgG有良好的免疫反应性;人新鲜血清对表达该表位的A549细胞具有明显的溶细胞效应。结论:1.成功构建肿瘤特异性启动子Survivin调控的、EGFP-GPI融合蛋白真核表达质粒pSGFP-GPI,且能在A549细胞膜上锚定表达EGFP-GPI融合蛋白,为构建锚锭表达型肿瘤疫苗奠定基础。2.成功构建肿瘤特异性启动子Survivin调控的、EGFP-gal-GPI融合蛋白真核表达质粒pSGFP-gal-GPI,且能在A549细胞膜上锚定表达包含α-gal模拟表位的EGFP-gal-GPI融合蛋白。本实验为探索肺癌及其它肿瘤的基因治疗和免疫治疗综合途径奠定了基础。
谭虎[8]（2008）在《vWF A3-GPI强化EPCs富集及其在损伤血管壁修复中作用的实验研究》文中提出研究背景血管内膜损伤后内皮修复主要依靠损伤血管内膜边缘的内皮细胞及循环中的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）。损伤局部边缘内皮增生、迁移形成的再生内皮常存在表型改变和/或功能紊乱,不能发挥正常内皮功能;而EPCs在微环境中能成为适宜局部生长的内皮细胞,并行使内皮细胞功能。因此,EPCs移植成为治疗血管损伤最有前景的方法之一。但由于缺乏特异性引导信号,EPCs在损伤处富集率低下往往导致移植效率不高。如能找到引导EPCs特异富集至受损血管内膜的相关分子,则可大大提高细胞移植效率。众所周知,血管损伤后血小板可特异黏附至损伤血管壁。如通过某种技术将血小板的特异黏附能力赋予EPCs,则可能解决此问题。介导血小板黏附至损伤血管壁最重要的分子是血管性假血友病因子（vWF）。vWF的A3区（vWF A3）是与内皮下胶原特异结合的关键部位。血管受损时,A3首先与暴露的内皮下胶原结合,再通过A1黏附血小板,从而介导血小板特异黏附受损血管壁。如果使移植EPCs携带vWF A3,则有可能使EPCs具有类似于血小板特异性黏附受损血管壁的能力。基因转染可使EPCs表达vWF A3,但如何才能控制其表达于细胞表面,而非细胞内呢?新兴的蛋白质转染技术为该问题的解决提供了策略。该技术利用基因工程手段将糖基化磷脂酰肌醇（glycosyl- phosphatidylinositol,GPI）与目的蛋白质融合表达,获得的目的蛋白能够通过其GPI结构锚定于细胞膜表面,而不跨越磷脂膜双层结构。应用此技术可能获得表面携带vWF A3的EPCs细胞,促进EPCs向血管内膜损伤局部富集。研究目的获得具有能与损伤血管壁内膜下胶原特异结合的新型引导分子的EPCs,检测其是否具有向损伤血管局部富集及促损伤血管修复的效应,为探索血管内膜损伤修复提供新思路。研究方法1.构建含GPI结构的vWF A3融合蛋白真核表达质粒通过RT-PCR方法分别获得血管性假血友病因子A3区（vWF A3）及GPI信号肽编码序列,通过PCR方法将FLAG标签加入GPI编码序列上游;通过酶切连接,将vWF A3编码基因和GPI编码基因同时插入到真核表达质粒pcDNA3.1（-）中。2.重组蛋白vWF A3-GPI的表达与纯化应用脂质体将pcDNA3.1（-）-vWF A3-GPI转染至CHO细胞, G418筛选。以荧光抗体流式细胞术（FCM）挑取阳性克隆。细胞爬片,免疫荧光激光共聚焦显微镜观察。磷脂酰肌醇磷脂酶C（PI-PLC）处理,FCM检测处理前后细胞表面融合蛋白变化。用免疫亲和层析方法纯化表达蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。3.重组蛋白vWF A3-GPI的生物活性分析采用ELISA分析重组蛋白vWF A3-GPI与胶原的结合活性,采用FCM分析vWF A3-GPI对EPCs细胞膜的锚定作用,采用CCK8法分析vWF A3-GPI修饰后EPCs增殖活性的变化及其胶原结合能力。4.定量分析移植EPCs/vWF A3在颈动脉损伤模型动物体内的分布联合使用3H-TdR标记或GFP标记方法检测移植EPCs在颈动脉损伤模型动物体内的分布,了解vWF A3锚定修饰EPCs是否可以促进移植EPCs向血管损伤部位优势分布。5.促血管修复效应检测Evans Blue染色观察损伤动脉再内皮化情况,HE染色测定新生内膜厚度、新生内膜面积、原始管腔和狭窄管腔面积、狭窄百分面积等。研究结果1.琼脂糖凝胶电泳发现,应用设计的引物,人脐静脉内皮细胞或人脐血单个核细胞总RNA的RT-PCR产物分别有670 bp或150 bp的荧光条带。2.重组质粒pcDNA3.1（-）-vWF A3-GPI酶切分析提示插入片段约820 bp;测序结果进行Blast比对,结果显示序列完全正确,且引入了FLAG标签,可用于下一步的表达、纯化实验。3.重组质粒转染CHO细胞,G418筛选到一株高表达克隆（阳性率99.95%,荧光强度为189.41）,PI-PLC处理后其阳性率降为5.7%,荧光强度为31.99;Western blot结果显示该融合蛋白分子量为60 KD;免疫荧光激光共聚焦显微镜显示该融合蛋白主要定位在细胞膜;SDS-PAGE凝胶电泳显示,抗FLAG抗体亲和层析柱层析产物中,有一条分子量约60 KD的单一条带,Western blot显示为带FLAG标签的融合蛋白。4.根据ELISA测定选择重组蛋白最佳孵育时间为2h,最佳孵育浓度为400ng/ml,锚定EPCs后12 h,其阳性率仍为89%以上,锚定后能被PI-PLC水解,可按比例结合胶原。5.EPCs被锚定后,增殖活性无明显变化;输入颈动脉损伤模型体内,再内皮化率由对照组的20.3±2.1%增至85.7±5.1%,分布至损伤血管细胞鼠与正常血管的比值则由对照组的3.63±0.10增至28.57±0.89,具有显着性差异;荧光显微镜观察到损伤血管内膜处有表达绿色荧光蛋白的细胞,新生内膜增生程度由对照组的75±19.3%降为21±3.6%。研究结论1.通过RT-PCR技术,可从人脐静脉内皮细胞提取RNA中成功克隆出人vWF A3基因,从人脐血单个核细胞提取RNA中成功克隆出GPI锚定信号肽基因;通过基因重组技术能构建vWF A3与GPI融合基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-vWF A3-GPI,并引入FLAG标签。2.构建的融合基因表达载体转染CHO细胞后能得到有效表达,分子量约为60 KD;融合蛋白主要以细胞膜锚定形式表达;表达有融合蛋白vWF A3-GPI的CHO细胞具有胶原结合活性;通过抗FLAG亲和层析,可以获得纯化的融合蛋白vWF A3-GPI。3.用蛋白质转染法,可以使EPCs细胞膜表面携带vWF A3-GPI,并具有相当的稳定性;同时保持其胶原结合能力。4.移植EPCs能归巢于血管损伤部位,分化为内皮细胞,抑制新生内膜增生;vWF A3-GPI锚定修饰能提高EPCs向损伤血管壁富集比例,增强移植EPCs防治血管狭窄效应。5.本研究借用血小板能特异黏附受损血管壁的特点,提出了用蛋白转染法制备引导EPCs特异结合损伤血管壁的引导分子的新设想,并为这一新设想的可行性和有效性提供了实验依据;该分子还可拓展于其它需要富集至损伤血管壁,参与损伤血管修复的细胞。
陶崑[9]（2008）在《GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体的构建及其抗白血病免疫效应研究》文中认为慢性粒细胞白血病（CML）的发生是由于t（9；22）（q34；q11）所致的bcr/abl融合基因编码产生具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。该蛋白是CML细胞的胞内蛋白，属于肿瘤特异性抗原。如何有效递呈BCR/ABL融合蛋白至CML细胞膜表面从而持续诱导机体产生特异性细胞免疫并成为效应细胞毒性T细胞（CTL）的靶向分子，一直是国内外研究的热点。本课题以bcr/abl融合基因为靶点，利用糖基化磷脂酰肌醇（GPI）能将重组蛋白锚定于细胞膜上的特点，辅以IL-12细胞因子佐剂，构建由GPI锚定修饰的慢粒白血病bcr/abl和鼠IL-12（mIL-12）真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12，并探讨其免疫原性及体内抗白血病效应，旨在探索以bcr/abl融合基因为靶点的免疫治疗策略治疗CML的可行性。实验从四方面进行研究，其主要方法、结果及结论如下：1.构建由GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI），在COS-7细胞中检测其基因和膜蛋白表达水平：以含有CML（b3a2型）migP210全长序列的质粒为模板，通过PCR扩增获得654bp的bcr/abl融合基因片段，酶切后插入真核双表达载体pBudCE4.1中，经鉴定获得重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl（PBB）。同时，RT-PCR扩增人外周血B淋巴细胞CD24锚定分子中的GPI信号肽序列，酶切后克隆入PBB质粒中与bcr/abl基因片段下游羧基端相连，获得重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl-GPI（PBBG）并鉴定。然后扩增mIL-12基因片段并亚克隆入PBBG另一多克隆位点，构建重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI）。在多聚阳离子介导下将PBBGI质粒转染COS-7细胞，采用RT-PCR、Western blot检测转染细胞bcr/abl融合基因及细胞膜上BCR/ABL融合蛋白的表达，ELISA检测mIL-12细胞因子的表达。经酶切和测序鉴定证实，由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL-12基因插入片段正确；转染的COS-7细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有BCR/ABL融合蛋白表达，转染细胞培养上清中也有IL-12的表达。2.建立细胞膜上能稳定表达BCR/ABL融合蛋白的SP2/0靶细胞株：通过脂质体介导将GPI锚定修饰的bcr/abl真核表达载体PBBG转染SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，经匀霉素高压筛选及克隆化培养获得2株阳性克隆细胞。Western blot检测鉴定，SP2/0阳性克隆细胞膜上有BCR/ABL融合蛋白的稳定表达，可作为CML体外CTL水平检测的特异性靶细胞。3.真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI）诱导小鼠特异性细胞免疫应答：BALB/C雌性小鼠随机分成5组（每组5只），采用肌肉注射方式进行免疫，即①pBudCE4.1空载组、②PBB重组质粒组、③PBBG重组质粒组、④PBBGI重组质粒组、⑤PBS对照组。每隔10d注射1次，共计3次。末次免疫后30d，分离各组小鼠脾淋巴细胞，经ConA体外刺激培养，MTT法检测脾淋巴细胞刺激指数（stimulation index, SI）及CTL细胞杀伤活性；ELISA法检测细胞培养上清中IL-2、IFN-γ表达水平。结果表明，PBBG、PBBGI重组质粒免疫组脾淋巴细胞刺激指数SI、IL-2、IFN-γ表达水平及CTL细胞毒活性与PBB、pBudCE4.1免疫组及PBS对照组比较,均存在显着性差异（P<0.05）；PBBGI免疫组IL-2、IFN-γ表达水平、CTL杀伤活性也明显高于PBBG质粒组，差异具有统计学意义（P<0.05），但二者间SI无显着性差异。4.真核双表达载体pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI）对CML模型鼠体内抗白血病效应研究：将pBudCE4.1空载及PBB、PBBG、PBBGI重组质粒作为基因疫苗通过肌肉注射方式分别免疫本课题组前期构建的bcr/abl逆转录病毒介导的小鼠CML骨髓转移/移植模型，每组3只，并以PBS为对照。每隔10d注射1次，共计3次。末次免疫后30d，取正常BALB/C小鼠及各免疫组模型鼠骨髓、脾脏及外周血，通过RT-PCR、Western blot检测骨髓细胞bcr/abl融合基因的转录水平及BCR/ABL融合蛋白的表达水平；通过脾脏病理切片，了解白血病细胞浸润情况；通过外周血白细胞计数及涂片分类，计数白细胞总数、粒系比例及幼稚细胞数量的变化。实验结果表明：PBBGI质粒免疫的CML模型鼠与PBBG、PBB及其它免疫组比较，骨髓细胞中bcr/abl融合基因及BCR/ABL融合蛋白的表达水平减弱；脾脏中CML细胞浸润程度明显减轻；外周血白细胞总数、粒系比例及幼稚细胞数量也呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。通过上述实验可以得出以下结论：1.成功构建了由GPI锚定修饰的、能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL-12的重组质粒pBudCE4.1-bcr/abl-GPI-mIL12（PBBGI），为我们后续研究bcr/abl融合基因诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础。2.建立了细胞膜上能稳定表达BCR/ABL融合蛋白的SP2/0靶细胞株，为体外检验bcr/abl融合基因激发小鼠特异性CTL应答提供了良好的实验工具和研究平台。3. GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体（PBBGI）具备免疫原性，能够诱导小鼠产生较高水平的细胞免疫应答，尤其是抗bcr/abl的特异性CTL应答。4. GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体能够缓解CML模型鼠白血病症状，抑制其白血病细胞生长，减轻致癌基因表达，使以bcr/abl融合基因为靶点的免疫治疗策略治疗CML具备了可行性。综上所述，本文以bcr/abl融合基因作为慢性粒细胞白血病免疫治疗靶点，成功构建了由GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体，并且证实了GPI的锚定修饰及IL-12细胞因子佐剂的协同作用能够明显增强bcr/abl融合基因诱导产生的特异性细胞免疫应答；同时该载体还能抑制CML模型鼠白血病细胞生长，减少致癌基因表达，显示出其潜在的肿瘤免疫治疗价值。
葛蕙心[10]（2007）在《糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1基因重组蛋白锚定肾癌细胞膜对提高细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤作用的研究》文中认为肾腺癌（adenocarcinoma of the kidney）又称肾细胞癌（renal cell carcinoma RCC）免疫过程主要是由T淋巴细胞介导，而T淋巴细胞的活化需要两个信号系统，第一信号是由T淋巴细胞受体（TCR）与抗原肽—MHC复合物相结合所提供；第二信号是由共刺激分子或辅助分子通过与T细胞上相应受体结合而传递。RCC缺乏共刺激信号的表达，使T淋巴细胞进入无反应状态或程序性死亡，出现RCC的免疫逃逸。B7-1分子是肿瘤免疫过程中重要的共刺激分子之一，它通过与T细胞表面的CD28受体结合介导第二信号，协同由CTR介导的第一信号，共刺激T细胞增殖并产生多种淋巴因子，促进并协调免疫反应的发生。RCC细胞因缺乏共刺激因子的表达而获得免疫逃逸，因此将B7-1与糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白融合，利用GPI锚的功能将B7-1靶向锚定在RCC细胞膜表面，这种B7-1修饰的肿瘤细胞膜可同时提供抗原特异性的第一信号和共刺激信号，有效激发CD4+，CD8+细胞及NK细胞的增殖和活化，能抵抗非修饰肿瘤细胞侵袭，一定条件下能降低肿瘤的复发和转移。糖基化磷脂酰肌醇（GPI）蛋白是一种细胞表面膜蛋白，通过GPI结构锚定于细胞表面，而不跨越其磷脂双层结构，亦无细胞内区。GPI蛋白可以被去污剂由细胞表面洗脱，以假微团的形式存在于溶液中，当再次与靶细胞或细胞膜共同孵育时，可自动再次锚定于细胞表面，并恢复其功能。本项研究依据肿瘤免疫过程中共刺激因子B7-1的作用，和GPI锚定信号的理论和方法，利用分子生物学手段，将B7-1胞外区编码序列同天然GPI蛋白衰变加速因子（DAF）C端编码的34个氨基酸的锚定信号的基因序列重组，将重组基因插入真核表达载体pCNA3，构建表达载体pCDNA3-GPI-B7-1与质粒pSV2-dhfr共转染CHO／DHFR-细胞，使得CHO／DHFR-稳定表达目的蛋白GPI-B7-1，再从该CHO／DHFR-上大量洗脱目的蛋白GPI-B7-1，并进行分离纯化，经Western Blot检测活性。提纯的目的蛋白锚定于原代培养出的RCC细胞膜上，与白体CTL细胞混合培养后，分离出该CTL细胞，检测其功能，并杀伤RCC细胞，观察CTL的活性，探讨GPI-B7-1作为肿瘤疫苗对于RCC的意义。并进一步探讨利用GPI锚定蛋白转化法制备肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫反应中的应用前景。结果和结论如下：1、通过直接免疫荧光证实，经pCDNA3-GPI-B7-1和质粒pSV2-dhfr-共转染CHO／DHFR-细胞，经筛选加压，能够稳定并高效表达目的蛋白GPI-B7-1。2、提取并纯化GPI-B7-1蛋白，经Western Blot检测具有免疫活性。3、通过原代培养建立了一株RCC细胞系CG-6327，并经过细胞形态学观察和电镜检测，证实为RCC细胞；经直接免疫荧光证实，CG-6327细胞上不表达B7—1分子。4、经直接免疫荧光证实，提取的GPI-B7-1蛋白可以锚定在该RCC细胞膜上。5、经过GPI-B7-1锚定的该RCC细胞膜可以作为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活化物，使得体外培养的CTL特异性杀伤该RCC的功能增强。上述结果表明，通过基因重组方法表达的GPI-B7-1锚定蛋白，可被转移并锚定在适宜的细胞膜上，并能恢复其功能。利用此蛋白转移的方法，使得RCC细胞膜表面再次出现共刺激信号，从而提供T细胞活化所需的双信号刺激，提高CTL对肿瘤的识别和杀伤能力。该研究为免疫治疗提供了一种新的方法和途径。
二、糖基磷脂酰肌醇锚定型小鼠B7.1融合蛋白的制备及抗肿瘤作用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、糖基磷脂酰肌醇锚定型小鼠B7.1融合蛋白的制备及抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
（1）表达非洲猪瘟病毒蛋白的重组酿酒酵母的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 非洲猪瘟病毒(ASFV) |
| 1.1.1 ASFV的病原学特征 |
| 1.1.2 ASFV的主要免疫原蛋白 |
| 1.1.3 ASFV的免疫机制 |
| 1.1.4 ASFV疫苗的研究进展 |
| 1.2 酵母口服疫苗 |
| 1.2.1 酵母表面展示系统的简介 |
| 1.2.2 酵母口服疫苗的免疫原理 |
| 1.2.3 酵母口服疫苗的优势 |
| 1.3 ASFV多基因串联表达型重组酿酒酵母 |
| 1.3.1 高尔基体蛋白酶锚定型酵母宿主底盘细胞的改造 |
| 1.3.2 ASFV多基因串联表达型重组酿酒酵母的设计 |
| 1.4 ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型重组酿酒酵母 |
| 1.4.1 Fc受体 |
| 1.4.2 ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型重组酿酒酵母的设计 |
| 1.5 ASFV蛋白膜锚定-分泌双表达型重组酿酒酵母 |
| 1.5.1 2A肽 |
| 1.5.2 ASFV蛋白膜锚定-分泌双表达型重组酿酒酵母的设计 |
| 1.6 研究内容 |
| 第2章 ASFV多基因酿酒酵母表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株、载体、细胞与质粒 |
| 2.2.2 主要试剂、溶液及培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ASFV基因的筛选与合成 |
| 2.3.2 蛋白酶高尔基体锚定酵母宿主菌的构建 |
| 2.3.3 三类表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母表达质粒的构建 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 ASFV基因及功能分析 |
| 2.4.2 .宿主菌ST1814G/TEV、ST1814G/R3C的构建 |
| 2.4.3 ASFV多基因串联表达型重组酵母的构建 |
| 2.4.4 ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型元件的构建 |
| 2.4.5 ASFV蛋白膜锚定-分泌双表达型元件的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 ASFV疫苗设计具有复杂性 |
| 2.5.2 表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母的设计与构建 |
| 2.5.3 ASFV酵母口服疫苗的免疫目标 |
| 2.5.4 多种因素影响ASFV多基因酵母表达载体的酵母转化效率 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 三类表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母的表达特征探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂、溶液及培养基的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 酵母培养 |
| 3.3.2 Western blot |
| 3.3.3 免疫荧光 |
| 3.3.4 流式细胞术 |
| 3.3.5 总RNA提取与c DNA合成 |
| 3.3.6 荧光定量PCR |
| 3.3.7 生长曲线测定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 表达 ASFV 蛋白的重组酿酒酵母中ASFV 蛋白的表达 |
| 3.4.2 表达ASFV 蛋白的重组酿酒酵母中ASFV 蛋白的定位 |
| 3.4.3 外源基因对表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母生长的影响 |
| 3.4.4 表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母中外源基因的表达水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 表达ASFV蛋白的重组酵母中目的蛋白的表达水平不一致 |
| 3.5.2 外源基因表达抑制表达ASFV蛋白的重组酵母的生长 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型重组酿酒酵母的免疫效力评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞、载体、动物及质粒 |
| 4.2.2 主要试剂、溶液及培养基的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞吞噬实验 |
| 4.3.2 P30、P54、K145R原核表达载体的构建 |
| 4.3.3 P30、P54、K145R原核蛋白表达及纯化 |
| 4.3.4 动物实验 |
| 4.3.5 ELISA测定抗体水平 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Fc片段对于PAM吞噬能力和IPEC-J2 胞吞能力的影响 |
| 4.4.2 K145R、P30、P54 原核蛋白的纯化 |
| 4.4.3 ASFV蛋白-猪Ig重链融合表达型重组酿酒酵母的免疫效力 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 Ig重链融合性抗原经Fc受体途径可介导抗原摄入 |
| 4.5.2 表达ASFV蛋白的重组酿酒酵母诱导产生较弱的免疫应答 |
| 4.6 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 同源臂序列 |
| 1.URR1 |
| 2.URR2 |
| 3.URR3 |
| 4.URR4 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（2）双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建双调控并荷载SPAG9 基因shRNA的溶瘤腺病毒 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、质粒、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 |
| 2.DD3-ZD55-SPAG9 的扩增、纯化与滴度测定 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 抑制前列腺癌细胞内SPAG9 蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.结晶紫染色检测DD3-ZD55-SPAG9+DTX对细胞的毒性作用 |
| 2.溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9 及多西他赛抑制前列腺癌细胞的生长 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞迁移能力 |
| 4.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞侵袭能力 |
| 5.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX促进前列腺癌细胞凋亡 |
| 6.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX下调SPAG9、Vimentin、MMP-2 蛋白,上调E-cadherin、caspase-8、casepase-3 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制裸鼠移植瘤生长 |
| 2. HE 染色 |
| 3.TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤凋亡 |
| 4.免疫组化法检测肿瘤组织中SPAG9 蛋白与EMT相关蛋白 |
| 5.Western Blot检测肿瘤组织内SPAG9和EMT相关蛋白表达情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究创新 |
| 存在的问题和改进方法 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 溶瘤腺病毒介导的抗肿瘤治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 嵌合抗原受体 T 细胞免疫治疗前列腺癌现状及进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 Abbreviation |
| 攻读学位期间参与发表的学术成果 |
| 致谢 |
（3）GPI-B7-1锚定肾癌细胞膜对细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤的促进作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 GPI-B7-1在CHO/DHFR-细胞表达的观察 |
| 1.3 GPI-B7的洗脱、鉴定及提取 |
| 1.4 RCC细胞的培养及建系 |
| 1.5 淋巴细胞分离、培养 |
| 1.6 不同RCC细胞膜作用下的CTL杀伤能力检测 |
| 1.7统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GPI-B7-1融合基因的表达产物鉴定 |
| 2.2 GPI-B7-1的鉴定结果 |
| 2.3 GPI-B7-1-RCC细胞膜活化CTL对自身肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 3 讨论 |
（4）mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗的抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系和实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 锚定mB7.1-GPI融合蛋白的CMT93细胞制备 |
| 1.4 细胞共培养及相关细胞因子检测 |
| 1.5 肿瘤疫苗对CMT93荷瘤小鼠的免疫治疗效果评价 |
| 1.6 CTL和NK细胞杀伤活性的测定 |
| 1.7 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 mB7.1-GPI融合蛋白大肠癌CMT93细胞膜的锚定作用 |
| 2.2 肿瘤细胞瘤苗刺激小鼠脾脏细胞分泌细胞因子的作用 |
| 2.3 肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用 |
| 2.3.1 肿瘤疫苗对肿瘤生长的抑制作用 |
| 2.3.2 荷瘤小鼠脾脏NK细胞杀伤活性 |
| 2.3.3 荷瘤小鼠脾脏CTL细胞的杀伤活性 |
| 2.3.4 荷瘤小鼠的生存期 |
| 3 讨论 |
（5）磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达以及单抗的筛选和制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 我国肝病的发病状况和研究进展 |
| 2 肝癌标志物GPC3的研究背景 |
| 3 肝癌的治疗手段 |
| 4 常用单克隆抗体制备的方法 |
| 5 本课题研究的内容与意义 |
| 第二章 GPC3的原核表达与鉴定 |
| 前言 |
| 1 实验材料,试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 单克隆抗体的筛选与鉴定 |
| 前言 |
| 1 实验材料,试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 噬菌体抗体的筛选 |
| 前言 |
| 1 实验材料,试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）肿瘤特异性锚定型α-gal模拟表位真核表达质粒的构建及功能研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Survivin 启动子调控的gal-GPI 融合基因真核表达载体的构建及表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肿瘤特异的gal-GPI 融合基因表达质粒在肺癌细胞中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本课题的创新点 |
| 有待深入的研究 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）vWF A3-GPI强化EPCs富集及其在损伤血管壁修复中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 vWF A3-GPI 强化EPCs 富集及其在损伤血管壁修复中作用的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 vWF A3-GPI 基因真核表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 vWF A3-GPI 的表达纯化及其生物学活性检测：胶原结合功能及蛋白质转染功能 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 vWF A3-GPI 加强EPCs 富集至损伤血管壁和抑制再狭窄的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 动脉损伤后内皮祖细胞归巢的调节 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 英文论着 |
（9）GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体的构建及其抗白血病免疫效应研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 GPI 锚定修饰的 bcr/abl 和 mIL-12 真核双表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体诱导小鼠特异性细胞免疫应答 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 GPI 锚定修饰的 bcr/abl 和 mIL-12 真核双表达载体对 CML 模型鼠的体内抗白血病效应 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本课题创新点 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的研究成果及发表学术论文目录 |
（10）糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1基因重组蛋白锚定肾癌细胞膜对提高细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 综述 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验方法 |
| 第一部分 GPI-B7-1CHO/DHFR~-细胞大量培养及GPI-B7-1稳定表达的鉴定 |
| 第二部分 目的蛋白GPI-B7-1的提取及鉴定 |
| 第三部分 RCC的原代培养及鉴定 |
| 第四部分 GPI-B7-1对RCC细胞膜的锚定和对提高CTL杀伤自体肿瘤细胞作用的研究 |
| 结果 |
| 第一部分 GPI-B7-1-CHO/DHFR~-细胞大量培养及GPI-B7-1稳定表达的鉴定 |
| 第二部分:目的蛋白GPI-B7-1的提取及鉴定 |
| 第三部分:RCC的原代培养及鉴定 |
| 第四部分:GPI-B7-1对肾癌细胞膜的锚定和对提高CTL杀伤自体肿瘤细胞作用的研究 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
四、糖基磷脂酰肌醇锚定型小鼠B7.1融合蛋白的制备及抗肿瘤作用研究（论文参考文献）
- [1]表达非洲猪瘟病毒蛋白的重组酿酒酵母的构建及免疫效力评价[D]. 陈琛. 天津大学, 2020(02)
- [2]双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究[D]. 杨春华. 苏州大学, 2019(06)
- [3]GPI-B7-1锚定肾癌细胞膜对细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤的促进作用[J]. 葛蕙心,张一兵,李慧忠,畅继武. 山东医药, 2016(29)
- [4]mB7.1-GPI膜表面修饰的结肠癌细胞疫苗的抗肿瘤作用研究[J]. 徐亚琨,易平勇,谢宇,江勃年. 肿瘤药学, 2012(04)
- [5]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达以及单抗的筛选和制备[D]. 黄侃. 华东师范大学, 2011(10)
- [6]mB7-1-GPI融合蛋白锚定Lewis细胞疫苗的制备及抗肿瘤作用[J]. 朱广,肖高明,王文祥,易平勇. 中国医师杂志, 2010(06)
- [7]肿瘤特异性锚定型α-gal模拟表位真核表达质粒的构建及功能研究[D]. 郭荫广. 重庆医科大学, 2010(05)
- [8]vWF A3-GPI强化EPCs富集及其在损伤血管壁修复中作用的实验研究[D]. 谭虎. 第三军医大学, 2008(03)
- [9]GPI锚定修饰的bcr/abl和mIL-12真核双表达载体的构建及其抗白血病免疫效应研究[D]. 陶崑. 重庆医科大学, 2008(11)
- [10]糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1基因重组蛋白锚定肾癌细胞膜对提高细胞毒性T淋巴细胞杀伤自身肿瘤作用的研究[D]. 葛蕙心. 天津医科大学, 2007(06)