一、细胞外基质蛋白1对MCF-7和HUVEC增殖影响的研究（论文文献综述）
程国荣[1]（2021）在《中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究》文中研究说明恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance,MDR）和侵袭转移的发生是临床上肿瘤治疗失败的主要原因。针对MDR和侵袭转移机制从中药中寻找高效、低毒的活性成分是目前抗肿瘤研究的重要课题之一。本论文从分子水平和细胞水平两方面出发,利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）筛选潜在的抗肿瘤活性成分,并基于代谢组学和细胞生物学相结合的研究策略对活性成分的逆转机制及抑制肿瘤侵袭转移作用机制进行深入研究。针对糖酵解过程中的关键限速酶-乳酸脱氢酶（LDH）在许多肿瘤细胞中高表达,被认为是浸润性癌重要靶点的特性,以LDH为靶分子,从中药中筛选其抑制剂。同时基于MDCK-MDR1细胞模型,进行P-糖蛋白（P-gp）介导的MDR逆转剂的筛选。1、中药中LDH抑制剂筛选建立固定化LDH方法,从大黄和虎杖中筛选潜在抑制剂。首先,以磁纳米粒子（MNPs）为载体,经氨基化修饰后,将LDH以共价键合的方式固定在MNPs表面,得到固定化LDH。为了获得最大的酶活力,采用单因素与响应面相结合的方法对固定化条件进行了优化,包括pH值、固定化时间和LDH浓度。在pH值为5.85、反应时间为3.14h、LDH浓度为0.37 mg/mL时,固定化LDH酶活性最佳,此时,LDH固定在MNPs上的量约为49μg/mg。随后,以galloflavin（阳性对照）、绿原酸和毛蕊花糖苷（阴性对照）为模型混合物,进行配体垂钓实验,对固定化LDH的特异性和选择性进行验证。最后,将固定化LDH方法与UPLC-MS/MS相结合,从两种富含蒽醌类化合物的天然产物（大黄和虎杖）中筛选潜在LDH抑制剂。从大黄和虎杖提取物中分别筛选并鉴定出9个和6个化合物,其中有3个化合物为二者所共有,这进一步证实了该方法的可行性。2、基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选利用P-gp过表达的MDCK-MDR1细胞,通过细胞毒性、罗丹明-123（Rh-123）蓄积与外排、Western blot实验和转运实验,对虎杖和白屈菜两种中药提取物及其主要成分进行P-gp抑制剂筛选研究。通过细胞毒性实验确定各个药物的IC20值,蒽醌类和多酚类化合物选择40、20、10 μM进行后续研究。Rh-123蓄积与外排实验显示虎杖提取物比白屈菜提取物对P-gp的抑制作用更强。对三类单体化合物比较,蒽醌类化合物对P-gp抑制作用最强,尤其是芦荟大黄素和大黄酚,其次是多酚类和3个毒性较大的生物碱。另外,通过不同药物处理时间对Rh-123蓄积的影响可以初步推测除虎杖苷、白藜芦醇三甲醚和白屈菜红碱外,其余化合物既能抑制P-gp的功能,又能抑制P-gp的表达。Western blot实验结果表明除虎杖苷和白屈菜红碱外,其余化合物均能抑制P-gp表达。选择效果最强的蕙醌类化合物芦荟大黄素、大黄酚和文献报道较多的白藜芦醇进行转运研究,结果表明芦荟大黄素和白藜芦醇能显着抑制P-gp底物地高辛的外排,而大黄酚没有这种抑制作用。此外,我们还补充了 5个结构相近且毒性较小的生物碱进行研究,发现苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱对P-gp均有较好抑制作用,有望成为MDR逆转剂。3、芦荟大黄素（AE）逆转MDR机制研究基于乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药模型,研究AE的逆转效果及机制。AE能显着逆转MCF-7/ADR细胞对阿霉素（ADR）的耐药性,其逆转指数为4.86。20μMAE与ADR联用对P-gp的表达没有抑制作用,但能显着促进ADR在耐药细胞中的蓄积。通过荧光显微镜观察,显示AE能使ADR更多的进入细胞核中,细胞核是ADR发挥抗肿瘤作用的场所。P-gp对ADR的外排需要ATP水解提供能量,而AE能降低细胞内ATP水平,因而推测AE通过抑制P-gp的外排功能来发挥逆转作用。能量代谢途径的研究结果表明,AE与ADR联用可抑制糖酵解、TCA循环、谷氨酰胺代谢及相关氨基酸合成途径。此外,我们还发现AE不仅可以逆转ADR诱导的耐药,还可以诱导自噬作为防御机制,抑制这一过程可增强AE的逆转活性。此外,AE与ADR联合用药还可以导致MCF-7/ADR细胞G2/M期阻滞并通过DNA损伤、ROS生成、caspase-3激活诱导细胞凋亡。4、芦荟大黄素（AE）和大黄素（EMD）抑制乳腺癌侵袭转移作用机制研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学方法对乳腺癌MCF-7细胞与人脐血静脉内皮细胞HUVEC共培养模型进行了考察,筛选并鉴定出25个生物标志物,涉及谷胱甘肽代谢、甲硫氨酸循环、嘌呤代谢和TCA循环等代谢通路,这些代谢通路均与肿瘤的恶性表型有关。采用共培养模型研究AE和EMD这两个同分异构体对MCF-7细胞侵袭转移的抑制作用。结果表明AE可以抑制MCF-7细胞的黏附、侵袭及血管生成,而EMD主要是抑制黏附。通过代谢组学的方法研究AE和EMD抑制MCF-7细胞侵袭转移的作用机制。AE和EMD组分别筛选出27个和13个生物标志物,涉及多胺代谢、维生素B6代谢、甲硫氨酸循环、TCA循环、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和天冬氨酸合成等通路。选择这些通路上的典型代谢物进行定量分析,发现AE能显着降低这些代谢物的含量且效果明显强于EMD。
何韶辉[2]（2021）在《尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究》文中认为研究背景尤文肉瘤是儿童和青少年第二常见的恶性骨与软组织肿瘤,具有好发年龄小（10-20岁）,恶性程度高,侵袭能力强,临床预后差等特点。局灶性尤文肉瘤的5年总体生存率约为65%,而发生于脊柱的尤文肉瘤患者仅为42%左右。高达80%尤文肉瘤患者在初诊时即伴有远处转移灶,其5年总体生存率低于30%。骨源性尤文肉瘤好发于四肢长骨干骺端,而起源于脊柱和骨盆的尤文肉瘤相对较少。事实上,受限于病例较少,目前临床研究中缺乏关于脊柱-骨盆尤文肉瘤患者发生转移的风险因素分析和预后预测模型的建立及验证的报道。机制研究上,为了筛选影响尤文肉瘤发生发展潜在的关键蛋白,我们通过前期系统的生物信息学分析发现细胞外基质蛋白Tenascin-C和去泛素化酶ZRANB1在尤文肉瘤组织中的表达水平分别升高和下降。然而目前关于Tenascin-C和ZRANB1在尤文肉瘤恶性生物学行为中的功能和相关机制尚不清楚。本论文从临床和基础研究角度出发,分别探究脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床预后模型,以及Tenascin-C和ZRANB1在尤文肉瘤进展中的功能和调控机制。研究目的1、建立基于大样本的脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床预后预测模型,并利用外部队列验证模型的稳定性,同时分析影响脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的风险因素。2、探索Tenascin-C调控尤文肉瘤进展中的功能和机制:（1）明确Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达情况及与临床预后的相关性。（2）明确Tenascin-C在调控尤文肉瘤进展中的作用。（3）明确Tenascin-C与融合蛋白EWS-FLI1的调控关系。（4）探索Tenascin-C调控尤文肉瘤进展的可能机制。3、探索ZRANB1调控尤文肉瘤进展中的功能和机制:（1）明确ZRANB1在尤文肉瘤中的表达情况及与临床预后的相关性。（2）明确ZRANB1在调控尤文肉瘤增殖中的作用。（3）探索ZRANB1调控尤文肉瘤进展的可能机制。1、利用“监控、流行病学特征及终点事件数据库”（SEER）收集371例符合入组条件的脊柱-骨盆尤文肉瘤患者的临床数据。通过Log-rank检验和Cox风险比例模型分析影响预后的临床因素,并根据鉴定的预后独立影响因素建立基于列线图的预测模型。而后利用本中心收治的脊柱-骨盆尤文肉瘤病例作为外部队列验证模型的稳定性。另外,通过logistic回归分析探讨影响脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的相关风险因素。2、（1）利用公共数据库和本中心收集的肿瘤标本,通过免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹等实验检测Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达情况,并结合临床随访数据分析Tenascin-C与尤文肉瘤患者预后的相关性。（2）利用CRISPR/Cas9编辑技术构建Tenascin-C敲除的单克隆尤文肉瘤细胞系。并利用CCK8增殖实验、Transwell迁移实验和HUVEC成管实验探究Tenascin-C对尤文肉瘤细胞增殖、迁移及血管生成能力的影响。通过构建裸鼠肺转移模型探讨Tenascin-C对尤文肉瘤细胞远处转移能力的影响。（3）利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因实验、以及染色质免疫共沉淀实验探讨Tenascin-C表达是否受融合蛋白EWS-FLI1的转录调控。（4）利用转录组测序分析Tenascin-C在尤文肉瘤中调控的潜在信号通路,并利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光实验进一步挖掘Tenascin-C调控尤文肉瘤恶性生物学行为的潜在机制。同时利用单细胞转录组测序分析尤文肉瘤中的细胞亚群,并与正常细胞群比较进一步验证Tenascin-C的表达情况及调控的信号通路下游基因的表达情况。3、（1）通过加权基因共表达网络分析法（WGCNA）挖掘影响尤文肉瘤进展的潜在基因,并通过本中心组织芯片验证基因的表达情况和预后价值。（2）通过慢病毒感染构建ZRANB1敲减和过表达的稳定细胞系,并利用CCK8增殖实验、细胞克隆形成实验以及裸鼠皮下荷瘤实验探究ZRANB1在调控尤文肉瘤增殖中的作用。（3）利用细胞转录组测序探索ZRANB1调控尤文肉瘤增殖的潜在机制,并利用免疫组织化学染色、蛋白质蛋白免疫印迹、放线菌酮实验、免疫共沉淀实验、体内泛素化实验以及流式细胞术等实验深入探讨ZRANB1调控尤文肉瘤增殖的具体机制。研究结果1、单因素和多因素生存分析发现,影响脊柱-骨盆尤文肉瘤患者预后的因素包材料与方法括患者的年龄,肿瘤范围、肿瘤体积大小以及原发部位手术。基于上述因素建立的预测模型内部和外部队列验证均显示模型具有良好的预测价值和稳定性。另外风险分析发现肿瘤大小>59mm和肿瘤侵犯淋巴结是脊柱-骨盆尤文肉瘤发生转移的高危因素。2、Tenascin-C促进尤文肉瘤的进展:（1）Tenascin-C在尤文肉瘤组织和细胞系中呈明显高表达,且Tenascin-C的表达情况与尤文肉瘤的总体生存期和无转移生存期均相关。（2）Tenascin-C能够促进尤文肉瘤的增殖、迁移和远处肺转移的能力,同时能够明显增强肿瘤微环境中血管生成能力。（3）Tenascin-C表达量与EWS-FLI1表达水平有关,而且EWS-FLI1能够通过直接结合Tenascin-C启动子区域,转录激活Tenascin-C的表达。（4）转录组测序分析提示Tenascin-C敲除后,部分差异基因富集于Hippo信号通路。利用单细胞转录组测序分析发现,尤文肉瘤由大量肿瘤细胞、成纤维细胞及少量的内皮细胞和血管平滑肌细胞组成,同时通过与正常间充质干细胞群比较,进一步验证了Tenascin-C在尤文肉瘤细胞群中的高表达状态。在肿瘤细胞群中,YAP正向调控的下游靶基因（CYR61和CTGF）表达明显上调,而负向调控的靶基因（DDIT4和TNFSF10）表达水平下降。上述测序结果提示Tenascin-C可能通过调控Hippo-YAP信号通路促进尤文肉瘤的恶性进展。进一步分析差异基因表达谱发现MALAT1差异最为明显。利用公共数据库也发现MALAT1在尤文肉瘤组织中表达明显高于正常对照组织。通过RNA荧光原位杂交实验进一步证实了MALAT1在尤文肉瘤组织中高表达,且与Tenascin-C的表达情况呈正相关。检测尤文肉瘤细胞敲除Tenascin-C后Hippo通路相关蛋白的表达,发现YAP的磷酸化水平（Ser127）降低,核定位比例增高。Hippo-YAP信号通路下游靶基因CYR61和CTGF表达量都相应增加。随后利用维替泊芬阻断YAP-TEAD转录复合体形成的实验发现,MALAT1表达水平显着下降。进一步检测Tenascin-C相关的细胞膜受体发现Integrinα5、αV和β1在肿瘤组织中表达水平较高。使用特异性抗体阻断Integrinα5,而非IntegrinαV,能够促进p-YAP（Ser127）的水平升高并使YAP滞留于胞浆内,与此同时MALAT1水平显着下降。检测Integrin下游激酶表达情况发现,Tenascin-C敲除后Src磷酸化（Tyr416）水平有所下降。使用Saracatinib特异性抑制Src激酶活性后发现,YAP主要定位于细胞胞浆内,且YAP下游靶基因MYC表达量也明显下降。3、ZRANB1抑制尤文肉瘤的增殖:（1）通过WGCNA和组织芯片染色分析发现ZRANB1在尤文肉瘤组织和细胞系中表达量下降,且ZRANB1低表达的尤文肉瘤患者临床预后较差。（2）敲减ZRANB1后,尤文肉瘤细胞增殖能力增强,而回补ZRANB1后,肿瘤细胞增殖受到明显抑制。（3）转录组测序分析提示ZRANB1调控尤文肉瘤增殖可能与溶酶体相关的信号通路有关。进一步蛋白免疫印迹实验发现ZRANB1能够抑制氨基酸刺激信号下的m TORC1活性,同时免疫组化分析发现ZRANB1低表达时,p-S6（Ser235/236）表达水平升高。我们利用流式细胞仪分析发现敲减ZRANB1后,尤文肉瘤细胞大小与正常对照组相比明显增大,而回补ZRANB1后细胞有所减小。接着我们发现ZRANB1能够促进该信号通路中的重要组分NPRL2的表达,放线菌酮实验证明ZRANB1能够增加NPRL2的稳定性。进一步蛋白质免疫共沉淀实验发现ZRANB1与NPRL2存在相互作用,且该相互作用可能依赖于ZRANB1的OTU结构域。最后,体内泛素化实验发现ZRANB1能够通过清除NPRL2蛋白的K48位多聚泛素链增强NPRL2的蛋白稳定性,进而抑制m TORC1的活性。研究结论1、基于临床预后独立影响因素建立的预测模型具有较好的稳定性和适用性,可用于临床初诊脊柱-骨盆尤文肉瘤患者时预后情况的预测和评价。临床实践中,若发现脊柱-骨盆尤文肉瘤患者影像学上肿瘤大小>59mm和/或肿瘤侵犯淋巴结组织,应高度怀疑肿瘤发生转移的可能。2、Tenascin-C在尤文肉瘤中表达水平明显升高,且与尤文肉瘤患者临床预后相关。功能上,Tenascin-C能够明显促进尤文肉瘤的增殖、迁移及远处转移能力,同时增强肿瘤微环境中的血管生成。机制上,特征性融合蛋白EWS-FLI1能够结合Tenascin-C启动子区域（nt-360～368）,转录激活Tenascin-C的表达。与此同时,Tenascin-C可通过Integrinα5/β1介导,激活Src,后者可进一步诱导YAP的去磷酸化和核转位,促进MALAT1和其他Hippo-YAP下游靶基因的表达。3、ZRANB1在尤文肉瘤中表达下调,且ZRANB1低表达的尤文肉瘤患者预后较差。ZRANB1能够通过清除NPRL2蛋白的K48位多聚泛素链抑制m TORC1的活性,进而抑制尤文肉瘤细胞的增殖能力。
张彦收[3]（2021）在《LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响》文中研究指明乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症数据显示,乳腺癌新发病例高达226万例,并已超过肺癌成为全球第一大癌症。在我国,女性恶性肿瘤发病首位同样为乳腺癌,每年发病人数约为30.4万。因此,对于乳腺癌预防、诊断和治疗的研究是目前医学领域工作的重点。当前,随着乳腺癌治疗模式的进步和新型药物的不断涌现,乳腺癌的治疗效果已取得了巨大突破。然而,乳腺癌耐药后出现的复发、转移仍然是困扰临床的难题之一。因此,研究乳腺癌的增殖、侵袭、转移机制,探寻新的治疗途径和靶点对提高乳腺癌的生存率至关重要。富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1,LRG1）是富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）家族蛋白成员,也是最早被发现的含有LRR结构的蛋白。人LRG1基因定位于染色体19p13.3,含有2810个碱基对,包括2个外显子和1个内含子。第一个外显子含43个碱基对,第二个外显子含1737个碱基对,共编码347个氨基酸残基。前35个氨基酸残基为信号肽,312个氨基酸残基构成单个肽链。因其定位的染色体区域同时存在数个编码中性粒细胞颗粒酶的基因,并且LRG1在人类MPD和HL-60细胞嗜中性分化过程中上调,而在HL-60细胞单核细胞分化过程中下调,早期研究认为LRG1可能是中性粒细胞早期分化的一种标志物。随着分子生物学技术的不断发展,LRG1的其它功能逐渐被发现:LRG1不仅参与细胞蛋白间的相互作用,同时在细胞信号转导、细胞黏附及发育过程中也发挥着重要作用。近些年研究显示LRG1在人类多种恶性肿瘤组织、血液、脑脊液、外泌体中异常表达,并且可以作为部分肿瘤早期诊断和预后判断的生物标记物。当前研究发现,LRG1在肿瘤的发生、发展、侵袭转移、上皮间质转化和异常血管生成过程中扮演重要角色,因此,LRG1在抗肿瘤治疗领域发挥的作用逐渐被大家重视。然而,LRG1在不同肿瘤中的表达存在明显差异,提示LRG1在不同肿瘤的发生、发展中可能发挥不同作用。如外泌体中LRG1与非小细胞肺癌发生发展有关;肝癌组织中LRG1表达较正常组织下调,体外实验显示LRG1对肝癌细胞增殖没有影响;卵巢癌患者血清和肿瘤组织中LRG1表达升高程度与肿瘤分期相关。LRG1在不同肿瘤中所发挥的作用正在积极探索之中。越来越多研究提示LRG1是抗肿瘤治疗的潜在靶点。但是,LRG1在乳腺浸润性癌中的表达、临床意义及作用机制有待进一步研究。本研究分三部分对LRG1在乳腺浸润性癌中的表达及临床意义进行了研究:第一部分:通过生物信息学方法分析不同肿瘤中LRG1mRNA及蛋白的表达情况,探索其与临床病理指标及预后的关系。第二部分:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测了330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达,进一步分析LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床病理指标及预后的相关性。第三部分:应用逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）技术、Western-blot技术检测不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况。采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力;划痕实验检测转染后细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。探讨LRG1对乳腺癌细胞生物学行为的影响。第一部分LRG1在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析目的:通过生物信息学方法分析LRG1在不同肿瘤中的表达及其临床意义。方法:基于人类癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库（http://www.tcga.org/）中肿瘤组织及正常组织中RNA-seq的测序结果,使用TIMER2.0在线工具（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析LRG1mRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达情况。从人类蛋白质图谱图像（the human protein atlas）数据库中（https://www.proteinatlas.org）中获取LRG1蛋白在不同肿瘤组织和正常组织中表达的情况。基于Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）中患者的临床特征、生存资料,分析不同肿瘤中LRG1mRNA的表达与总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（recurrence free survival,RFS）之间的关系,并绘制Kaplan-Meier曲线。结果:1.LRG1mRNA在乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）（1097例）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）（533例）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）（515例）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）（545例）、甲状腺癌（thyroid carcinoma,THCA）（501例）中的表达量显着高于相对应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.分析The Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org）数据库中LRG1蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC、THCA组织中的表达情况,结果显示LRG1蛋白在此五种癌组织中表达水平显着高于癌旁正常组织。3.分析LRG1mRNA在BRCA不同亚型中表达情况。566例Luminal型乳腺癌中LRG1表达量为37.462（9.930-74.197）,高于HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（P<0.01）。根据淋巴结转移情况进一步分析显示,1646例淋巴结阳性患者组LRG1mRNA表达量高于2415例淋巴结阴性组,差异具有统计学意义（P<0.0001）。17例粘液腺癌中LRG1mRNA的表达量明显低于其它浸润性癌（浸润性导管癌、浸润性小叶癌及混合型癌）,差异具有统计学意义（P<0.0001）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中生存数据,LRG1mRNA的表达与Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型乳腺癌的OS无明显关系（均P>0.05）,但在Basal-like亚型中,LRG1的表达与OS显着相关,LRG1表达低的乳腺癌患者OS较好（HR=3.12,95%CI=1.54-6.29,P<0.001）。4.在KIRC中,随着临床分期的升高,LRG1mRNA的表达呈上升趋势。Ⅳ期患者LRG1的表达量显着高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异具有显着性（P<0.01）。在不同组织学分级中,呈现同样趋势,组织学分化3级患者组LRG1表达量显着高于1、2级（P<0.01）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中530例KIRC患者的OS及RFS数据并绘制生存曲线,结果显示367例LRG1高表达组患者OS低于163例低表达组,LRG1mRNA的表达与OS显着相关（HR=1.71,95%CI=1.18-2.47,P=0.0042）。LRG1mRNA的表达与RFS关系与OS一致,LRG1高表达组患者RFS低于低表达组（HR=3.57,95%CI=1.26-9.87,P=0.0089）。在肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）数据中,同样发现LRG1mRNA表达水平可以预测患者OS及RFS,高表达组患者OS及RFS均差于低表达组,差异具有显着性（OS:HR=2.19,95%CI=1.2-4.01,P=0.0091;RFS:HR=5.32,95%CI=1.2-22.54,P=0.011）。5.LUAD组织中LRG1mRNA的表达量显着高于正常组织。在正常肺组织中,LRG1mRNA中位表达量为25.277（20.394-30.683）,在LUAD组织中表达量为35.431（20.538-53.567）,差异具有统计学意义（P<0.001）。分析503例肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）和52例正常组织的数据,发现LRG1mRNA在正常组织中表达水平显着高于LUSC（26.701 vs 11.612,P<0.001）。LRG1mRNA在LUAD和LUSC中的表达存在明显差异。在LUAD组,222例LRG1高表达组患者OS低于282例低表达组,LRG1mRNA表达与OS显着相关（HR=1.34,95%CI=1-1.8,P=0.045）。6.LRG1mRNA在UCEC组织中表达量为24.37（10.368-48.392）,高于正常子宫内膜组织表达（10.072,2.357-14.296）,差异具有显着性（P<0.001）,LRG1mRNA在UCEC中呈现高表达,但与年龄、临床分期、月经状态及预后无显着相关性。7.LRG1mRNA在THCA中的表达量随着淋巴结转移个数的增多而升高,具有统计学意义（P=0.027）,在预后方面,261例LRG1高表达组患者OS优于241例低表达组,且具有显着性差异（HR=0.11,95%CI=0.02-0.48,P=0.00035）。结论:1.LRG1mRNA及蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC及THCA中表达显着上调,LRG1可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要促进作用。2.Luminal型乳腺癌中LRG1mRNA表达量高于HER-2阳性型和三阴性,LRG1与Basal-like亚型乳腺癌的OS呈负相关。3.KIRC中LRG1mRNA的表达可以预测OS及RFS,LRG1表达与OS、RFS呈负相关。4.LRG1mRNA在LUAD中表达上调,LRG1高表达提示患者OS较差。5.LRG1mRNA在UCEC中表达上调,但与临床特征及预后无显着相关性。6.LRG1mRNA在THCA中表达与淋巴结转移个数呈正相关,与OS呈显着正相关。第二部分乳腺癌组织中LRG1蛋白表达与临床特征及生存预后的关系目的:探讨乳腺癌组织LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床特征及生存预后的关系。方法:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达情况,探讨LRG1与乳腺癌患者年龄、月经、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移状况、组织学分级、分子亚型及生存预后的相关性。结果:1.LRG1蛋白在原发性乳腺癌中表达情况。在330例原发性乳腺癌患者中,58.48%（193例）患者LRG1呈阳性表达。LRG1着色部位主要位于细胞质,阳性信号表现为褐色颗粒状外观。2.LRG1蛋白的表达与临床病理指标的关系。0-3个淋巴结转移组LRG1阳性表达128例,阴性表达121例,阳性表达率51.41%;3个以上淋巴结转移组LRG1阳性表达65例,阴性表达16例,阳性表达率80.25%,两组间LRG1阳性表达率存在显着性差异（χ2=20.939,P<0.001）。LRG1的表达与淋巴结转移负荷呈正相关,随着淋巴结转移数量的增多,LRG1的阳性表达率升高。Ⅰ-Ⅱ期患者组LRG1阳性表达124例,阴性表达125例,阳性表达率62.96%;Ⅲ期组LRG1阳性表达69例,阴性表达12例,阳性表达率85.19%。两组间LRG1阳性表达率的差异有统计学意义（χ2=31.520,P<0.001）。LRG1的表达与肿瘤负荷呈正相关,随着疾病的进展,LRG1的阳性表达率升高。3.LRG1蛋白的表达与乳腺癌DFS（disease-free survival,DFS）、OS的关系。330例患者中位随访时间72个月,92例患者出现局部复发或远处转移,80例患者死亡。LRG1阳性表达组72个月的DFS为61.14%（118/193）,阴性表达组DFS为87.59%（120/137）,两组间DFS存在显着差异（χ2=27.123,P<0.001）。72个月OS与DFS结果相似,共出现80例死亡事件,总体人群72个月OS为75.76%。LRG1阳性表达组72个月的OS为66.32%（128/193）;LRG1阴性组为89.05%（122/137）,两组间差异有显着性（χ2=22.864,P<0.001）。4.影响DFS及OS的COX回归模型多因素分析COX多因素分析显示LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌患者DFS和OS的独立危险因素（P<0.05）。肿瘤大小、组织学分级、年龄、月经状态与DFS、OS无显着相关性（P>0.05）。LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型对DFS的风险比分别为2.090、3.214和1.796;对于OS的风险比分别是2.112、2.628和1.755。结论:1.乳腺癌LRG1蛋白的表达与年龄、月经状态、肿瘤大小、组织学分级、分子亚型无关。2.乳腺癌LRG1蛋白的表达与淋巴结转移个数呈正相关,随着淋巴结转移个数的增多,LRG1的阳性表达显着升高。3.乳腺癌LRG1蛋白的表达与病理TNM分期相关,分期越晚,LRG1的阳性表达越高。4.LRG1蛋白的表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌DFS、OS的独立危险因素。LRG1表达水平与DFS、OS呈负相关。第三部分LRG1在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响目的:验证乳腺癌细胞系中LRG1的表达是否与乳腺癌组织中表达一致,为LRG1在乳腺癌发生、发展及侵袭转移中的作用提供理论支持。方法:主要应用了RNA干扰技术、RT-PCR、Western-blot技术和细胞划痕实验等方法,观察不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况,抑制LRG1表达后细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:1.RT-PCR方法检测乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1mRNA的表达。在三种不同乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3）中,LRG1mRNA表达水平差别显着,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量（0.1260±0.0070）,较MDA-MB-231细胞（0.1103±0.0081）、SK-BR-3细胞（0.0703±0.0027）相对表达量显着增高。2.MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1蛋白的表达。在三种不同乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3中,LRG1蛋白的表达存在显着差别,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1蛋白相对表达水平最高（10.9510±0.6721）,显着高于MDA-MB-231（7.8492±0.1327）、SK-BR-3细胞（4.3906±0.1914）。3.采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达。Western-blot技术检测检测转染成功后MDA-MB-231细胞中LRG1蛋白的表达,结果显示,转染组（MDA-MB-231-Si）中LRG1蛋白表达量（0.4105±0.1906）较对照组细胞（MDA-MB-231）中的表达量（0.8295±0.1295）明显降低,差异具有显着性（P<0.05）。4.CCK-8实验检测细胞增殖能力。转染成功后,CCK-8实验检测各组细胞在24h、48h、72h和96h后450 nm处OD值。结果显示:随着时间的延长,转染组（MDA-MB-231-Si）增殖率明显低于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞增殖能力下降。5.细胞划痕实验检测细胞迁移能力。划痕实验分别检测处于对数生长期的对照组、转染阴性对照组、转染组细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231-Si）细胞的迁移能力。划痕0小时测得的划痕区面积:对照组细胞（MDA-MB-231）、转染组细胞（MDA-MB-231-Si）、转染阴性对照组细胞（MDA-MB-231-NC）分别为:15.054±0.122,14.679±0.142,13.407±0.112。划痕24小时后测得的划痕区面积分别为:6.714±0.131,9.559±0.122,5.217±0.132。面积缩小的比值依次为:55.40%,34.88%,61.08%。乳腺癌MDA-MB-231-Si细胞在划痕24小时后的迁移率均明显低于对照组（MDA-MB-231）、转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）,差异有显着性（P<0.05）。6.Transwell实验检测细胞侵袭能力。Transwell侵袭实验显示转染组（MDA-MB-231-Si）穿膜细胞数少于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞侵袭能力下降。结论:1.MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量,较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞相对表达量显着增高。2.MCF-7细胞中LRG1蛋白的相对表达水平较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞显着增高。3.si-RNA干扰LRG1表达后可减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
韩博[4]（2020）在《榄香烯对三阴性乳腺癌小鼠的治疗效果与作用机制研究》文中认为乳腺癌的发病率和死亡率位居女性癌症患者首位。临床上通常根据其分型进行针对性治疗,主要包括化疗、激素治疗、靶向治疗和免疫治疗。其中,三阴性乳腺癌由于雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2,Her-2）表达均为阴性,无法从激素治疗和靶向治疗中获益。此外,三阴性乳腺癌比受体阳性的乳腺癌更易发生转移。当前主要依靠紫杉类、蒽环类、环磷酰胺和铂类药物的组合治疗,患者生存率较为低下。与此同时,由于这些传统的化疗方法缺少靶向性,通常会产生严重的毒副作用,一些年老体弱以及患有其他疾病的肿瘤患者难以耐受,因而出现无药可用的困境。中药作为肿瘤治疗的补充药物正得到越来越多的关注。莪术是传统中药中常用的活血化瘀类药材,早期的临床试验和相关基础研究发现其挥发油提取物榄香烯具有一定的抗肿瘤活性。既往的临床应用发现,榄香烯乳液在癌性胸腹水及消化道肿瘤的治疗方面具有一定疗效,且毒副作用相对较低,老年体弱的患者可耐受。然而,已有的研究报道主要集中于榄香烯的细胞毒机制,关于榄香烯的药理还有很多不明了之处,对临床应用的指导价值不足。本研究根据莪术的临床药理特点,从榄香烯对肿瘤微环境作用的角度出发,在分子、细胞、组织和动物整体水平上系统研究榄香烯对三阴性乳腺癌的治疗作用与机制,以期为临床应用提供理论和实验依据。本文使用CCK8（Cell Counting Kit-8）法检测了榄香烯对小鼠乳腺癌细胞株4T1、小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人脐静脉内皮细胞株HUVEC、小鼠成纤维细胞株NIH3T3、大鼠心肌细胞株H9C2活性的影响,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测了榄香烯对4T1细胞凋亡的影响。向6-8周龄雌性Balb/c小鼠乳腺脂肪垫内注射4T1细胞,建立三阴性乳腺癌原位移植瘤小鼠模型;给予每日一次腹腔注射榄香烯（1mg/kg,5mg/kg,10mg/kg和20mg/kg）治疗,设置不治疗对照组和每周腹腔注射一次紫杉醇（paclitaxel,PTX;20mg/kg）组。治疗3周后处死小鼠,摘取脏器进行组织病理研究。通过H&E染色观察肿瘤细胞在肝脏和肺脏的转移情况;通过免疫组化染色检测组织内HIF-1α、CD31、NLRP3、caspase1和IL-1β的表达;使用二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）作为荧光探针观察肿瘤组织内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。研究结果表明,当浓度低于20μg/mL及以下时,榄香烯对肿瘤细胞和正常细胞均未表现出明显的细胞毒性,当浓度为30μg/mL时,榄香烯具有显着的细胞毒作用,并诱导肿瘤细胞凋亡。根据细胞实验结果,在动物实验中使用了低中剂量进行治疗。生存实验的结果表明,榄香烯治疗组（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg）与低剂量紫杉醇组（20mg/kg）乳腺癌小鼠的生存时间相近,均显着长于对照组乳腺癌小鼠。组织病理学研究表明,连续治疗3周后,低中剂量榄香烯乳（1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg）虽然对小鼠原位肿瘤的尺寸没有显着影响,但能够显着抑制肿瘤细胞向肺和肝脏的转移,同时对荷瘤小鼠脾脏肿大的现象有缓解作用。在机理研究方面,我们发现榄香烯通过下调乳腺癌小鼠肿瘤组织中HIF-1α及其下游蛋白CD31的表达而抑制肿瘤组织内血管新生,从而减少了肿瘤细胞的转移。与此同时,榄香烯能够抑制乳腺癌小鼠肿瘤组织中炎症小体NLRP3的表达,从而通过抑制Caspase-1活化而抑制IL-1β的表达,表明其具有抑制炎性反应的作用。电子自旋共振谱的检测结果表明,榄香烯具有清除活性氧（reactive oxygen species,ROS）的功能,包括DPPH、超氧阴离子和羟自由基。细胞实验结果显示,榄香烯显着降低脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）引起的小鼠巨噬细胞RAW264.7胞内ROS的升高和炎性因子Il-1β和Tnf-α转录水平的升高,证实榄香烯可通过清除ROS发挥其抑炎作用。在组织水平上,通过二氢乙啶染色观察到榄香烯治疗组小鼠肿瘤组织内的ROS水平显着下调,说明榄香烯可通过清除ROS来抑制HIF-1α和NLRP3的表达。综上,本研究通过细胞、组织和动物整体层次的系统实验,阐明榄香烯乳在低中剂量下细胞毒性较低且具有清除ROS的功能,通过减少乳腺肿瘤组织中的ROS而改善肿瘤组织的缺氧和炎性微环境,抑制了肿瘤新生血管的形成,降低了肿瘤细胞向肺和肝脏的转移,也缓解了荷瘤小鼠脾脏肿大的现象,延长了小鼠生存期。本研究的创新性在于揭示了榄香烯在主要通过对肿瘤组织微环境的改善调理而实现其抗肿瘤效应,而不是基于对肿瘤细胞的杀伤作用,但在高浓度下榄香烯对血管内皮和成纤维细胞具有较明显的细胞毒性。建议在临床应用中将榄香烯作为改善肿瘤微环境的治疗药物,而不宜将其作为细胞毒化疗药物。
梁子[5]（2020）在《HBV起源的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制及功能研究》文中提出目前已发现许多真核生物编码circRNAs,越来越多的研究显示circRNAs具有miRNAs海绵体、与蛋白质相互作用、调节基因转录、翻译蛋白等功能,circRNAs在许多疾病的发生、发展过程中扮演重要的角色,并有可能成为新的药物治疗靶点。最近的一些研究发现,人类疱疹病毒EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）、卡波西肉瘤疱疹病毒（Kaposi’s Sarcoma Herpesvirus,KSHV）和人乳头瘤病毒16型（Human Papillomavirus 16,HPV16）等一些具内含子的病毒基因的转录本可以形成circRNAs。乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）是引发原发性肝癌的重要原因之一,已有一篇研究报道了1条起源于HBV前体基因组pgRNA的circRNA,并发现该circRNA并不是通过常规的反向剪接形成的,宿主的RNA解旋酶DHX9（DEx H-Box Helicase 9）参与了HBV circRNA的形成,但HBV形成circRNA的机制仍未明确,有关HBV起源的circRNA的功能研究仍没有涉及。本课题组前期的研究中发现了一个新的HBV编码的circRNA（命名为HBV＿circ＿1）,初步体外研究结果证实HBV＿circ＿1能抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖、提升HBV复制水平,并发现HBV＿circ＿1可能通过miRNA-6124/ST7轴和与细胞周期蛋白依赖性激酶-1（（Cyclin Dependent Kinases 1,CDK1））互作促进肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）的发生和发展。本研究在此基础上,深入探讨了HBV编码的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制,研究了HBV＿circ＿1对肿瘤发生与发展过程的影响、抑制细胞自噬及其作用机制,探讨了HBV＿circ＿1编码X蛋白的可能性。有关研究结果不仅能进一步加深对HBV基因组编码信息的理解,为circRNA的形成提供新的机制,也可从新的角度阐释HBV引起原发性肝癌的机制,为从RNA水平上治疗HBV感染引起的肝癌提供新靶点。1、HBV＿circ＿1来源及形成机制HBV编码的新circRNA HBV＿circ＿1长度约为2.5kb,其序列与HBV基因组（Gen Bank accession No.KU668446.1）489-2985 nt区域的序列对应,前期的研究通过PCR、Sanger测序以及Northern blotting对HBV＿circ＿1进行了初步验证。本研究在确认HBV＿circ＿1是环状RNA分子的基础上,通过序列比对和HBV＿circ＿1序列测定确认HBV＿circ＿1来源于HBV的pgRNA。HBV＿circ＿1上含有两个Junction sites（分别命名为Junction site A和Junction site B）。研究结果证实Junction site A是由位于pgRNA末端的正向重复序列通过同源重组形成,Junction site B是由切除pgRNA上对应于HBV基因组（Gen Bank accession No.KU668446.1）489-3182-2985nt区域的序列后连接形成,位于pgRNA末端的正向重复序列可促进circRNA形成,推测该过程有蛋白参与。2、HBV＿circ＿1对肿瘤发生与发展的影响前期的研究结果显示HBV＿circ＿1能抑制肝癌细胞HepG2细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖、提升HBV复制水平,暗示HBV＿circ＿1可能在肿瘤的形成和发展中发挥重要作用。本研究进一步探讨了HBV＿circ＿1对不同细胞表型特征的影响。流式细胞术检测结果显示,与转染表达circ GFP的对照质粒pLCDH-circ＿GFP相比,转染表达HBV＿circ＿1的质粒pLCDH-HBV＿circ＿1能促进正常小鼠肝细胞AML-12、人脐静脉内皮细胞HUVEC和肝癌细胞HepG2、SMMC-7721的增殖,加快AML-12、HUVEC和SMMC-7721的细胞周期进程;将转染pLCDH-HBV＿circ＿1或转染pLCDH-ciR空载的SMMC-7721细胞移植至裸鼠,结果显示,HBV＿circ＿1能促进SMMC-7721细胞在体内形成肿瘤。PCR结果显示,在转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体组织中存在HBV＿circ＿1,除在一例成瘤小鼠的肝脏组织中检测到HBV＿circ＿1外,在其他组织（心脏、肾脏、小肠、胃、肌肉以及脑）中均未检测到HBV＿circ＿1。对瘤体进行HE染色和免疫组化的结果显示,转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体的恶性程度以及瘤体中Ki67和Cyclin D1的表达水平均高于对照组。这些结果表明,HBV＿circ＿1能加快细胞周期进程,促进细胞增殖,促进肿瘤的形成与发展。3、HBV＿circ＿1抑制细胞自噬及机制研究自噬在肿瘤的发生与发展中扮演重要角色,本研究中从自噬角度探讨了HBV＿circ＿1促进肿瘤发生、发展的机制。Western blotting和细胞免疫荧光的结果显示,瞬时表达HBV＿circ＿1能促进p62的累积和聚集、抑制LC3-II形成、抵消雷帕霉素对自噬的促进作用,而敲降HBV＿circ＿1的表达促进HepG2.2.15细胞自噬的发生,说明HBV＿circ＿1可以抑制细胞自噬。免疫组化的结果显示,在注射表达HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体中p62的累积量明显高于对照组,证实了HBV＿circ＿1能够抑制自噬。qPCR结果显示,调节HBV＿circ＿1表达对自噬起始复合物关键基因的表达无明显影响,暗示HBV＿circ＿1不参与调节自噬起始过程。RNA pull down、RIP实验结果证实HBV＿circ＿1与PHB2互作。信息学分析结果显示,PHB2与HBV＿circ＿1的结合区域包含了PHB2与LC3的结合区域,暗示HBV＿circ＿1可能与LC3竞争性结合PHB2。CO-IP实验证实,HBV＿circ＿1可抑制PHB2与LC3之间的相互作用,而HBV＿circ＿1的突变体（缺失与PHB2结合区域）则不能与LC3竞争性结合PHB2,也失去了抑制细胞自噬的作用。这些结果表明HBV＿circ＿1通过与LC3竞争性结合PHB2发挥抑制自噬的作用,并由此促进肿瘤的发生与发展,研究结果为理解HBV的致癌机理提供了新的视角,也为HBV诱导的肝癌治疗提供了新的靶点。4、HBV＿circ＿1能够编码X蛋白已有研究证实部分circRNAs能以帽子结构非依赖性方式编码蛋白。对HBV＿circ＿1序列进行了信息学分析,发现HBV＿circ＿1上有HBx的完整开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）、内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）和N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,推测HBV＿circ＿1具有编码X蛋白的潜力。细胞免疫荧光检测结果显示,在转染HBV＿circ＿1表达质粒pLCDH-HBV＿circ＿1的HepG2细胞中存在少量X蛋白;用Ds Red序列替换pLCDH-HBV＿circ＿1质粒中HBx的ORF,构建pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red重组质粒,在转染pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red的HepG2细胞中也能观察到Ds Red的表达。进一步,通过免疫组化在转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体中检测到X蛋白,而在转染pLCDH-ciR的SMMC-7721细胞形成的对照瘤体中检测不到X蛋白。以上结果说明HBV＿circ＿1能够编码X蛋白。研究结果从HBV＿circ＿1编码X蛋白的角度解释了HBV＿circ＿1促进癌症的发生、发展过程的机制。
徐明[6]（2020）在《SPOCK1/SIX1信号轴调控乳腺癌演进的机制研究》文中研究表明研究背景:乳腺癌是世界女性患者中诊断率最高、最致命的妇科恶性肿瘤,由于其发病率的居高不下而广受关注。尽管针对原发性乳腺癌的治疗已取得重大进展,但现阶段还没有治愈以及预防乳腺癌发生浸润及远处转移的方法。研究数据表明:乳腺癌一旦发生转移,患者的5年生存率仅能达到26%,乳腺癌远处转移是影响患者生存预后最主要的因素,也是患者临床治疗的根本挑战。癌症的侵袭、转移过程涉及到多种基因和细胞内信号传导通路的参与,是多阶段、复杂的生物学过程,也是科研工作者急需攻克的重点、难点。因此,深入研究并阐明乳腺癌细胞增殖、转移的分子机制,寻找新的、特异性高、针对性强的诊断和治疗靶点,为乳腺癌患者的临床治疗提供新的治疗策略,为进一步提高乳腺癌患者的预后提供理论依据。睾丸蛋白聚糖1（SPOCK1）属于多域睾丸蛋白多糖家族,该蛋白家族包括:SPARC、睾丸素-2和睾丸素-3,与细胞增殖和转移有关。SPARC蛋白已在多种癌症中被报道,参与细胞增殖、血管生成、凋亡和上皮细胞向间质转化等过程。近年来,越来越多的学者开始关注SPOCK1是否也在肿瘤发生、发展过程中发挥作用。有研究报道,SPOCK1与肿瘤的远处转移有关,可激活Wnt/β-catenin、mTOR-S6K和NF-κB等信号通路,并参与了肿瘤的增殖、凋亡和转移的过程,证实了 SPOCK1可作为一个新的促癌因子参与调控癌症的发生、发展。另有研究显示,SPOCK1在乳腺癌组织中呈异常高表达,且与其不良预后显着相关,但并未阐明其在乳腺癌进展过程中具体发挥的作用及调控机制。因此,明确SPOCK1诱导乳腺癌演进的潜在机制和功能,为提高乳腺癌患者的预后提供理论基础。同源盒基因1（SIX1）在多种肿瘤细胞中高表达,如肝癌、乳腺癌、结肠癌等,且可提示患者的临床不良预后。已有研究证实,SIX1作为转录因子参与上皮-间质转化的过程,促进肿瘤细胞的侵袭及浸润。然而,SIX1与SPOCK1在乳腺癌演进的机制中是否存在相互作用关系尚不清楚。研究目的:旨在明确SPOCK1、SIX1对乳腺癌演进的影响,并阐明其发挥作用潜在的分子机制:1.评估SPOCK1、SIX1在乳腺癌患者早期诊断和临床预后中的作用及应用价值;2.揭示SPOCK1在乳腺癌细胞周期、增殖、转移及上皮-间质转化过程中发挥的作用及潜在的调控机制;3.探究SPOCK1参与调控的下游靶基因,进一步阐释其参与乳腺癌演进的潜在分子机制。研究方法:1.乳腺癌数据库数据及组织标本染色分析:1)通过Oncomine、HPA（The Human Protein Atlas）和Ualcan数据库检索分析乳腺癌组织中SPOCK1和SIX1的表达情况;2)应用免疫组织化学法评估SPOCK1蛋白在80例人乳腺癌组织切片中的表达情况及其高表达与患者临床病理学参数之间的关系;3)通过Kaplan Meier-plotter和SurvExpress数据库绘制患者生存分析曲线图,分析乳腺癌患者高表达SPOCK1或SIX1在其预后评估中的潜在作用。2.体外实验:1)Western blot实验检测SPOCK1在不同乳腺癌细胞系中的蛋白表达情况;2)选择SPOCK1表达相对较高的MCF7和SKBR3和相对较低的MDA-MB-231和HS 578T细胞系分别构建SPOCK1慢病毒沉默及高表达细胞株;3)通过噻唑蓝实验（MTT）、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU）增殖实验、平板克隆和流式细胞术等实验检测SPOCK1对乳腺癌细胞周期及增殖的影响,同时通过Western blot实验检测细胞增殖及周期相关蛋白的变化;4)应用细胞划痕、侵袭和浸润实验检测差异表达SPOCK1对乳腺癌细胞侵袭、转移能力的影响,同时通过Western blot技术检测EMT相关标志蛋白的变化情况;5)应用UCSC Xena和 GEPIA2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2）数据库检索,分析SPOCK1与EMT相关标志物的作用关系,随后,采用免疫荧光和Western blot实验进行验证;6)采用Western blot方法评估差异表达SPOCK1对AKT/mTOR通路相关蛋白表达的影响;7)加入PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂Rapamycin后检测由SPOCK1高表达诱导的细胞增殖、转移及EMT的改变;8)免疫荧光细胞共定位及免疫共沉淀实验验证SPOCK1与SIX1的相互作用关系;9)利用小干扰RNA敲减SIX1蛋白的表达,检测其对SPOCK1高表达诱导的细胞周期、增殖、转移及EMT过程的影响。3.体内实验:1)在裸鼠的乳腺脂肪垫内接种慢病毒差异表达SPOCK1的乳腺癌细胞,比较移植瘤的形成情况;2)裸鼠尾静脉内注射慢病毒差异表达SPOCK1的乳腺癌细胞,建立肺转移瘤模型,比较裸鼠肺转移灶形成的情况,进一步通过苏木素-伊红染色进行确认;3)采用免疫组织化学法对裸鼠瘤体组织切片进行染色,比较差异表达SPOCK1时瘤体组织Ki67及EMT标志蛋白E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果:1.SPOCK1在乳腺癌中异常高表达,且与患者预后不良相关:SPOCK1在乳腺癌组织中表达的阳性率及强阳性率分别为93.8%和72.5%,显着高于正常乳腺组织（30%,10%）（P<0.001）,且与患者的组织学分化程度和淋巴转移情况相关。SPOCK1高表达的患者较低表达患者的预后风险高且伴随较短的生存期;2.SPOCK1高表达促进乳腺癌增殖及细胞周期进程:高表达SPOCK1可以促进乳腺癌细胞的增殖及克隆形成能力,加快细胞周期进程,并可以促进裸鼠原位移植瘤的生长,而沉默SPOCK1则相反;3.SPOCK1可通过EMT途径促进乳腺癌转移:SPOCK1高表达可提高乳腺癌细胞能动性,促进其迁移、侵袭及浸润能力,加快EMT进程,增加裸鼠乳腺癌细胞肺转移,而沉默SPCOK1时则结果相反;4.SPOCK1通过激活AKT/mTOR信号通路诱导乳腺癌恶性进展:SPOCK1的致癌活性与AKT/mTOR信号通路的活化紧密相关。在加入PI3K和mTOR抑制剂后则逆转由SPOCK1诱导的乳腺癌细胞增殖、转移及EMT进程;5.SIX1在乳腺癌中呈高表达,且与SPOCK1具有相互作用:SIX1在乳腺癌组织中高表达且与患者不良预后有关。差异表达SPOCK1后SIX1的表达也随之改变,进一步免疫共沉淀实验证实二者确实存在相互作用关系;6.SPOCK1/SIX1信号轴通过激活AKT/mTOR信号通路调节乳腺癌演进:敲低SIX1的表达后可显着逆转由高表达SPOCK1诱导的乳腺癌细胞增殖、转移及EMT进程。结论:1.SPOCK1和SIX1在乳腺癌中均呈高表达,并提示患者不良预后;2.SPOCK1高表达可加快细胞周期进程、促进细胞增殖、并可通过EMT途径增强乳腺癌细胞的转移;3.SPOCK1/SIX1信号轴通过活化AKT/mTOR信号通路调控乳腺癌的演进;4.SIX1基因的表达缺失可逆转SPOCK1对乳腺癌恶性行为的促进作用。
陈宇斐[7]（2020）在《EVs介导的乳腺癌细胞与HUVEC相互作用机制研究》文中研究指明目的:通过体外实验证实乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞源胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）生物学特性的影响,以及HUVEC源性EVs对MDA-MB-231和MCF-7细胞生物学特性的影响,探讨两种细胞间的相互作用关系,以期说明血管内皮细胞参与肿瘤进程的可能作用机制,并为乳腺癌的治疗提供新的策略和思路。方法:（1）采用差速超速离心法分离乳腺癌细胞源EVs,透射电镜观察乳腺癌细胞源EVs形态;Nanosight检测乳腺癌细胞源EVs的粒径分布;Western blot检测乳腺癌细胞源EVs表面蛋白CD9、CD63的表达情况。（2）免疫荧光观察乳腺癌细胞源EVs被HUVEC内化过程。（3）通过MTT法和平板克隆实验检测乳腺癌细胞源EVs对HUVEC的增殖影响,观察不同浓度乳腺癌细胞源EVs处理后HUVEC的形态学变化;通过划痕实验和Transwell实验检测乳腺癌细胞源EVs对HUVEC迁移作用;通过成管实验检测乳腺癌细胞源EVs对HUVEC的成管影响;通过Western blot检测乳腺癌细胞源EVs对HUVEC的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达情况。（4）通过平板克隆实验观察乳腺癌细胞源EVs对AG490抑制剂处理后的HUVEC增殖的影响;通过划痕实验和Transwell实验检测乳腺癌细胞源EVs对AG490抑制剂处理后的HUVEC迁移作用;通过成管实验检测乳腺癌细胞源EVs对AG490抑制剂处理后HUVEC的成管影响;Western blot检测乳腺癌细胞源EVs对AG490抑制剂处理后的HUVEC的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达情况。（5）通过MTT法和平板克隆实验检测不同浓度的HUVEC-EVs对乳腺癌细胞的增殖影响;通过划痕实验和Transwell实验检测HUVEC-EVs对乳腺癌细胞的迁移和侵袭作用;通过Western blot检测HUVEC-EVs对乳腺癌细胞的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达情况。结果:（1）镜下观察乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞源EVs呈杯状或盘状结构的膜性纳米级囊泡,直径在几十到几百不等;通过Western blot检测乳腺癌细胞源EVs表面蛋白发现其表达CD9和CD63,符合EVs的一般表面标记。（2）免疫荧光证实了乳腺癌细胞源EVs可以被HUVEC内化。（3）MTT、平板克隆实验、Transwell实验、划痕实验和成管实验结果显示,乳腺癌细胞源EVs处理后的HUVEC的增殖、迁移、成管能力明显增强;AG490抑制剂处理后,HUVEC增殖、迁移、成管能力下降。（4）Western blot结果显示随着乳腺癌细胞源EVs浓度的增加,p-JAK2、p-STAT3表达增加;而加入AG490抑制剂后,p-JAK2、p-STAT3表达减少。（5）MTT、平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验结果显示,HUVEC-EVs处理后的乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭明显增强。（6）Western blot结果显示随着HUVEC-EVs浓度的增加,p-JAK2、p-STAT3表达增加。结论:乳腺癌细胞源EVs可通过JAK2/STAT3途径促进HUVEC的增殖、迁移和成管,同样HUVEC-EVs也可以通过JAK2/STAT3途径促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果进一步证实,阻断肿瘤组织血管生成是乳腺癌治疗的有效途径之一。
宋雪晴[8]（2020）在《基于乳腺癌分型和炎性微环境设计的Pt（Ⅳ）前药分子的研究》文中认为乳腺癌是威胁女性健康的头号杀手,2011年St.Gallen专家共识首次透过形态学“现象”分析了分子“本质”,即根据其雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）分子的表达差异,将乳腺癌分为不同亚型,包括Luminal A型、Luminal B型、HER2阳性型以及三阴性乳腺癌（TNBC）,这一突破性进展对于临床精准治疗方案的设计具有重大意义。此外,受肿瘤炎性微环境影响,肿瘤转移复发也成为临床乳腺癌治疗的关键。顺铂,作为一线抗癌药物在临床被广泛使用,具有药效强,抗癌谱广的优点,但由于其选择性和溶解性差引起的毒副作用及固有/获得性耐药问题的存在,严重影响了患者的治疗效果。近年来,随着铂药研究不断深入,Pt（Ⅳ）化合物以其独特的稳定性和结构可塑性在众多研究中脱颖而出。其遵循前药作用模式,呈动力学惰性且较少引起副作用;同时轴向配体的引进增强了药效,改变传统Pt（Ⅱ）药的入胞模式,促进摄取,提高生物利用度,有效克服耐药问题等;入胞后释放出配体与铂药母核,发挥高效协同抗癌功效,改善传统意义的联合给药缺陷。因此,本文选取了一系列对乳腺癌分型和肿瘤炎性微环境特征具有独特药理活性的分子,作为配体引入到Pt（Ⅳ）轴向位置上,旨在开发靶向型精准药物,有效克服乳腺癌临床治疗缺陷,减少化疗造成的毒副作用。目的:针对乳腺癌分型、肿瘤炎性微环境和铂药的临床缺陷,本文设计合成了一系列具有靶向作用的Pt（Ⅳ）前药分子,使其在乳腺癌细胞内发挥高效协同作用,并降低药物的系统毒性。方法:本研究选取具有（或修饰后具有）羧基、氨基活性基团的褪黑素、酮基布洛芬、依托度酸、卡洛芬、舒林酸等衍生物分别与羟基铂进行缩合获得Pt（Ⅳ）前药分子候选物,并通过核磁氢谱、碳谱、高分辨质谱、高效液相色谱等方法对所得化合物进行结构及理化性质表征。采用MTT、ICP-MS、流式细胞术、Western blot、Hoechst染色、免疫荧光、彗星、划痕侵袭等实验对药物的作用机制进行探索;建立荷瘤裸鼠模型,制作H&E染色切片对药物的抑瘤活性及体内毒性进行评估。结果:一、ER阳性乳腺癌在临床最为常见,ER通过与雌激素结合发挥生物学效应。褪黑素作为人体内源性产物与乳腺癌的发生密切相关,且对雌激素相关酶类和受体具有调节作用。基于此,本文首次设计合成4个褪黑素-Pt（Ⅳ）前药分子Melatplatin。其中化合物3对ER阳性MCF-7细胞具有突出的选择性且细胞毒性较顺铂提高近100倍,这与3的受体亲和力增强并有效抑制ER表达的结果相吻合。化合物3在胞内大量蓄积并还原释放出铂药母核与配体MT来发挥药物的协同作用,诱导严重的S期阻滞和DNA损伤,上调γH2AX和P53表达。在体内,化合物3造成肿瘤组织的严重坏死并缓解系统毒性。此外,MT的引入有效激活了机体免疫系统,促进淋巴细胞增殖,实现免疫化疗的可能。二、突破三阴乳腺癌的临床治疗缺陷,本文首次设计合成了酮基布洛芬-Pt（Ⅳ）分子Ketoplatin,其对MDA-MB-231（TNBC）细胞具有非常好的选择性和超强的细胞毒活性。该药物通过在胞内大量蓄积并还原释放出铂药母核和配体ketoprofen,一方面诱导严重的DNA损伤和S期阻滞,促进细胞凋亡;另一方面遏制COX-2表达,下调vimentin和N-cadherin,逆转EMT进程,有效抑制肿瘤细胞转移侵袭。此外,在荷瘤小鼠体内Ketoplatin发挥高效低毒的抗癌功效。三、炎性微环境是保护和维持肿瘤发展和复发转移的基础,环氧合酶-2（COX-2）作为促炎因子与肿瘤炎性微环境密切相关,且在多数肿瘤组织中高表达。基于此,本文对课题组开发的3个非甾体抗炎药-Pt（Ⅳ）分子进行了相关活性机制研究。其中Etoplatin在MCF-7细胞中抑制效果最佳,通过抑制COX-2改善肿瘤微环境的炎性情况,抑制vimentin和MMP-2,上调E-cadherin逆转EMT机制,降低肿瘤细胞的转移侵袭,并在荷瘤小鼠体内发挥高效低毒的抗癌效果。结论:本文针对不同乳腺癌分子分型及炎性微环境设计合成了一系列的Pt（Ⅳ）分子,改变了顺铂原始作用模式,在靶细胞内发挥了出色的细胞毒作用,有效纠正致癌基因表达,诱导严重的DNA损伤、周期阻滞和细胞凋亡,调节肿瘤炎性微环境,抑制癌细胞的侵袭转移,克服肿瘤耐药,激活机体免疫,并于荷瘤小鼠体内发挥高效低毒的抗癌作用。该结果将为后期实现Pt（Ⅳ）前药分子的临床应用提供重要的理论依据。
岑峻宇[9]（2020）在《乳腺癌外泌体TSP1促进肿瘤细胞穿过血管内皮发生转移的机制研究》文中提出肿瘤细胞发生转移是导致癌症患者死亡的重要原因之一。肿瘤转移主要包括肿瘤细胞从原位逃逸、浸润、穿过血管或淋巴管,在管腔内转移,定位远处器官,并在远端定位处增殖等一系列过程。其中,肿瘤细胞通过营造具有自身特点的肿瘤微环境,进而帮助肿瘤细胞突破血管屏障进入血液循环系统,是肿瘤细胞发生转移的关键步骤之一。肿瘤微环境中包含肿瘤细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞等,这些细胞之间可以直接相互作用,也可以通过分泌囊泡、蛋白核酸分子发生间接作用。肿瘤细胞来源的外泌体是肿瘤微环境中细胞外囊泡的一种,含有蛋白质、核酸等细胞代谢和组成成分,在肿瘤浸润过程中对肿瘤微环境的塑造,特别是对于血管内皮细胞胞间连接的重塑起着至关重要作用。本研究利用细胞生物学、生物化学、分子生物学的方法,以及体外和体内细胞转移模型,揭示了乳腺癌细胞外泌体对癌细胞穿过血管内皮的作用及其分子机理。乳腺癌细胞的分泌物是肿瘤微环境的重要组成部分。为了研究肿瘤微环境对肿瘤穿过血管内皮的影响,本文首先收集了乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养上清,通过分离其上清及其富含外泌体组分和不含外泌体组分,利用体外细胞穿透实验发现细胞培养上清和富含外泌体组分能促进肿瘤细胞穿过血管内皮,其中富含外泌体组分的促进作用更加显着。本研究进一步提取了乳腺癌细胞的外泌体,发现用乳腺癌细胞外泌体处理血管内皮细胞后,血管内皮细胞胞间连接分子VE-cadherin和ZO-1的表达显着降低,成管能力减弱,提示乳腺癌细胞外泌体可能通过破坏血管内皮胞间完整性,进而促进肿瘤细胞穿过血管内皮。究竟是外泌体中哪种或哪部分蛋白在此过程中起到关键作用?本研究通过获取外泌体蛋白质质谱数据,利用生物信息学方法的Gene Ontology富集分析,发现在外泌体中含有多个与黏附和转移相关的蛋白质组分组。血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1,TSP1）是质谱检测出的可信度最高的蛋白质,且出现在四个得分较高的GO富集项中,与黏附、转移等生物学过程相关的候选分子中共有候选蛋白分子,提示TSP1可能是调节肿瘤细胞转移的关键蛋白。研究进一步发现,相对于非转移性乳腺癌细胞系MCF7,TSP1在高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达,并且TSP1在外泌体中表达显着高于细胞裂解液,提示TSP1可能促进乳腺癌转移。进一步验证实验表明,过表达TSP1蛋白的MCF7细胞,其外泌体中TSP1蛋白含量增加,并能显着促进肿瘤细胞穿过血管内皮;而沉默TSP1蛋白的MDA-MB-231细胞来源外泌体中TSP1含量减少,其促进肿瘤细胞穿过血管内皮的能力减弱。以上结果说明乳腺癌细胞来源的外泌体中TSP1是促进肿瘤细胞穿过血管内皮的关键蛋白。乳腺癌外泌体中TSP1是如何促进肿瘤细胞穿过血管内皮?深入研究结果表明肿瘤细胞来源的外泌体TSP1作用于HUVECs胞间连接蛋白VE-cadherin和ZO-1,进而破坏血管内皮胞间连接完整性。过表达TSP1蛋白的肿瘤细胞外泌体显着抑制HUVECs的VE-cadherin和ZO-1的表达,而敲低THBS1基因的肿瘤细胞外泌体或利用TSP1抑制剂LSKL处理的肿瘤细胞外泌体反而提高了血管内皮细胞中这两种胞间连接蛋白的表达。以上结果表明乳腺癌外泌体TSP1下调血管内皮细胞胞间连接蛋白。为了验证乳腺癌外泌体TSP1在体内能否降低血管内皮细胞连接完整性,进而促进乳腺癌穿透血管内皮发生迁移。本研究在斑马鱼模型中发现过表达TSP1的乳腺癌外泌体能够降低斑马鱼血管内皮连接分子VE-cadherin、ZO-1、CD146的表达,且过表达TSP1的乳腺癌细胞发生转移的数量显着高于低表达TSP1乳腺癌细胞组。证明了TSP1不仅能破坏斑马鱼血管内皮细胞胞间连接,同时增强乳腺癌细胞在斑马鱼体内迁移能力。显示TSP1过表达的外泌体处理斑马鱼后,乳腺癌细胞更容易发生转移。综上,本论文揭示了肿瘤细胞来源的外泌体TSP1促进乳腺癌转移这一重要作用,明确了肿瘤细胞穿过血管发生转移的重要机制,为乳腺癌临床治疗的有效干预提供了新靶点。
卓定浩[10]（2019）在《糖鞘脂GM1影响乳腺上皮细胞增殖和迁移的研究》文中研究表明糖鞘脂是一类含有亲脂性神经酰胺尾部和亲水性寡糖基头部、广泛分布于细胞膜表面的糖脂。GM1是一种含有唾液酸的糖鞘脂,具有维持细胞膜稳态,调控细胞增殖、粘附、识别和信号传导等重要作用,另外还参与了癌症的发生和发展。然而,GM1对乳腺上皮细胞增殖和迁移的调控作用和相关分子机制仍不清楚。因此,研究GM1对乳腺上皮细胞增殖和迁移的影响,有助于深入了解GM1在乳腺癌发生发展中的作用,为乳腺癌的治疗提供实验基础。本课题以乳腺上皮细胞为研究对象,分析外源添加和内源改变GM1对细胞增殖和迁移的影响,提出GM1调控乳腺上皮细胞增殖和迁移的可能机制。主要研究结果如下:（1）外源添加GM1能够抑制乳腺上皮细胞在高密度时的细胞增殖。通过EdU细胞增殖、Western blot和流式细胞术等实验证实在高密度时,乳腺上皮细胞MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549和SK-BR-3存在接触抑制生长现象。流式细胞术和薄层层析检测发现细胞在高密度时GM1表达显着升高。外源添加GM1能抑制高密度细胞增殖,抑制EGFR信号通路激活,但对常规密度细胞增殖没有影响。（2）内源过表达GM1能够抑制乳腺上皮细胞在高密度时的细胞增殖。通过慢病毒转染技术构建GM1敲低和过表达稳定转染细胞株,发现过表达GM1能够抑制高密度细胞增殖,抑制EGFR信号通路激活,而敲低GM1则表现出相反的结果。此外,过表达或敲低GM1对常规密度细胞增殖能力和EGFR活性没有显着影响。（3）GM1能够通过促进EGFR在小窝区的分布来抑制EGFR的激活。利用膜组分分离、免疫共沉淀和OptiPrep密度梯度离心等实验检测发现,相较于常规密度细胞,在高密度细胞中,EGFR在糖鞘脂富集区（GEM）的分布减少,在小窝区的分布增加。免疫荧光染色实验表明,细胞在高密度时,外源添加GM1能够促进EGFR在小窝区分布,抑制EGFR在糖鞘脂富集区分布。综合以上结果,本文提出GM1调控乳腺上皮细胞增殖的可能机制:即GM1通过促进EGFR从糖鞘脂富集区到小窝区的分布来抑制EGFR的激活,进而抑制细胞增殖。（4）过表达GM1能够促进乳腺上皮细胞迁移。通过检测上皮间质转化（EMT）相关蛋白标志物表达,发现过表达GM1能使MCF-10A细胞发生类似EMT的变化。细胞悬滴聚集和细胞贴壁实验证实过表达GM1后细胞之间的粘附能力减弱、细胞与胞外基质之间的粘附增强。Transwell细胞迁移实验表明过表达GM1能促进细胞迁移。TGF-β处理细胞检测发现过表达GM1能够促进TGF-β诱导细胞发生EMT。总结以上,内源性过表达GM1能够使乳腺上皮细胞提高迁移能力及发生类似EMT的变化。（5）外泌体中GM1含量增加能增强癌细胞来源外泌体促进乳腺上皮细胞移的作用。通过Western blot、transwell细胞迁移等实验确认MDA-MB-231细胞的条件培养基能够使MCF-10A和MCF-7细胞提高迁移能力及发生其他EMT相关变化,而在MDAMB-231细胞中过表达GM1能够增强条件培养基的这种作用。利用差速离心法从条件培养基中提取外泌体,并通过外泌体标志物检测、粒径检测、透射电镜等实验确认提取的外泌体符合标准。通过免疫电镜、密度梯度离心、流式细胞术等实验证实外泌体存在GM1的表达,并且供体细胞过表达GM1能够提高外泌体中GM1含量。外泌体处理MCF-10A细胞证实内源性过表达GM1能增强癌细胞来源的外泌体的如下作用,即促进乳腺上皮细胞迁移和诱导乳腺上皮细胞发生类似EMT的相关变化。
二、细胞外基质蛋白1对MCF-7和HUVEC增殖影响的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞外基质蛋白1对MCF-7和HUVEC增殖影响的研究（论文提纲范文）
（1）中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肿瘤多药耐药的产生及分子机制 |
| 1.1.1 药物转运泵的外排 |
| 1.1.2 酶系统的改变 |
| 1.1.3 细胞周期的改变 |
| 1.1.4 膜脂的改变 |
| 1.1.5 细胞凋亡与自噬的改变 |
| 1.2 中药逆转肿瘤多药耐药的研究 |
| 1.3 肿瘤的侵袭转移 |
| 1.3.1 血管生成对肿瘤转移的作用 |
| 1.3.2 黏附分子在肿瘤转移过程中的作用 |
| 1.3.3 细胞降解机制在肿瘤转移过程中的作用 |
| 1.3.4 肿瘤微环境 |
| 1.4 细胞代谢组学研究 |
| 1.4.1 代谢组学概论 |
| 1.4.2 代谢组学研究流程 |
| 1.4.3 细胞代谢组学在肿瘤研究中的应用 |
| 1.5 本论文的研究思路 |
| 第2章 中药中乳酸脱氢酶抑制剂筛选研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 样品与试剂 |
| 2.2.2 LDH功能化磁纳米粒子的制备 |
| 2.2.3 表征 |
| 2.2.4 固定化LDH的活性测定及固载量计算 |
| 2.2.5 LDH固定化条件的优化 |
| 2.2.6 固定化LDH配体筛选条件优化 |
| 2.2.7 使用固定化LDH从大黄和虎杖提取物中筛选抑制剂 |
| 2.2.8 UPLC-MS/MS条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固定化LDH的表征 |
| 2.3.2 LDH固定化条件优化结果 |
| 2.3.3 固定化LDH配体筛选条件优化结果 |
| 2.3.4 大黄中LDH抑制剂筛选及鉴定 |
| 2.3.5 虎杖中LDH抑制剂筛选及鉴定 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 样品与试剂 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 毒性实验 |
| 3.2.4 细胞内Rh-123蓄积实验 |
| 3.2.5 细胞内Rh-123外排实验 |
| 3.2.6 Western Blot实验 |
| 3.2.7 转运实验 |
| 3.2.8 UPLC-MS/MS定量分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 中药提取物/单体化合物的细胞毒性研究 |
| 3.3.2 中药提取物/单体化合物对Rh-123蓄积的影响 |
| 3.3.3 中药提取物/单体化合物对Rh-123外排的影响 |
| 3.3.4 中药提取物/单体化合物对P-gp表达的影响 |
| 3.3.5 中药提取物/单体化合物的转运研究 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 芦荟大黄素逆转肿瘤MDR作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 样品与试剂 |
| 4.2.2 细胞培养与毒性实验 |
| 4.2.3 细胞内ADR蓄积实验 |
| 4.2.4 Western Blot实验 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR实验 |
| 4.2.6 ADR在细胞内的分布 |
| 4.2.7 细胞内ATP含量的测定 |
| 4.2.8 能量代谢相关通路的定量分析 |
| 4.2.9 细胞周期实验 |
| 4.2.10 细胞内ROS水平的测定 |
| 4.2.11 Caspase-3活性测定 |
| 4.2.12 凋亡实验 |
| 4.2.13 定量与统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AE逆转乳腺癌多药耐药 |
| 4.3.2 AE抑制P-gp的外排功能 |
| 4.3.3 AE对细胞内ADR分布的影响 |
| 4.3.4 AE降低细胞内ATP含量 |
| 4.3.5 AE对能量相关代谢通路的影响 |
| 4.3.6 AE能诱发MCF-7/ADR细胞自噬 |
| 4.3.7 AE对细胞周期的影响 |
| 4.3.8 AE对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 芦荟大黄素和大黄素抑制肿瘤侵袭转移作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 样品与试剂 |
| 5.2.2 细胞培养 |
| 5.2.3 细胞毒性实验 |
| 5.2.4 MCF-7细胞与内皮细胞黏附实验 |
| 5.2.5 MCF-7细胞侵袭转移实验 |
| 5.2.6 MMP-2、MMP-9和VEGF活性测定 |
| 5.2.7 软琼脂克隆实验 |
| 5.2.8 代谢组学细胞样品制备 |
| 5.2.9 UPLC-MS条件 |
| 5.2.10 数据处理和分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MCF-7单独培养与共培养方式的比较 |
| 5.3.2 芦荟大黄素和大黄素的细胞毒性 |
| 5.3.3 芦荟大黄素和大黄素降低内皮细胞对MCF-7细胞的黏附 |
| 5.3.4 芦荟大黄素和大黄素抑制MCF-7细胞的侵袭转移 |
| 5.3.5 芦荟大黄素和大黄素对MCF-7细胞代谢的影响 |
| 5.3.6 生物标志物的定量分析 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 硕博连读期间发表的学术论文 |
（2）尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脊柱-骨盆尤文肉瘤临床预后模型的建立与外部验证 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二部分 Tenascin-C调控尤文肉瘤进展的功能和机制研究 |
| 第一章 Tenascin-C在尤文肉瘤中的表达及功能研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 Tenascin-C与融合蛋白EWS-FLI1 的关系研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 Tenascin-C调控经Integrinα5β1 介导的Hippo-YAP通路 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三部分 去泛素化酶ZRANB1 调控尤文肉瘤进展的功能和机制研究. |
| 第一章 基于加权基因共表达网络分析筛选和验证目的基因 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 ZRANB1 通过去泛素化NPRL2 调控尤文肉瘤增殖 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 文献综述 |
| 一、尤文肉瘤的流行病学特征和诊疗进展 |
| (一)尤文肉瘤的流行病学特征 |
| (二)尤文肉瘤的诊疗进展 |
| (三)尤文肉瘤治疗的潜在药物靶点 |
| 二、细胞外基质与肿瘤的关系 |
| (一)细胞外基质概述 |
| (二)细胞外基质重塑在肿瘤发生发展中的作用 |
| (三)Tenascin-C在肿瘤发生发展中的功能和机制 |
| 三、Hippo信号通路与肿瘤的关系 |
| (一)Hippo信号通路概述 |
| (二)YAP/TAZ在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| (三)YAP/TAZ作为药物靶点在肿瘤治疗中的应用 |
| 四、去泛素化酶与肿瘤的关系 |
| (一)去泛素化酶概述 |
| (二)去泛素化酶在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| (三)去泛素化酶ZRANB1 调控肿瘤恶性行为的研究进展 |
| 五、mTORC1 信号通路与肿瘤的关系 |
| (一)mTORC1 信号通路概述 |
| (二)mTORC1 信号通路在肿瘤发生发展中的作用及相关机制 |
| 六、总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间个人发表论文和参加科研工作的情况 |
| 致谢 |
（3）LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LRG1 在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌组织中LRG1 蛋白表达与临床特征及生存预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LRG1 在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 LRG1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）榄香烯对三阴性乳腺癌小鼠的治疗效果与作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 榄香烯简介 |
| 1.2 榄香烯抗肿瘤效应 |
| 1.2.1 引起细胞周期阻滞 |
| 1.2.2 诱导细胞凋亡 |
| 1.2.3 抑制血管生成 |
| 1.2.4 抑制肿瘤细胞侵袭和转移 |
| 1.2.5 逆转耐药及放、化疗增敏 |
| 1.3 榄香烯临床试验研究概述 |
| 1.3.1 恶性胸腹腔积液 |
| 1.3.2 中晚期肝癌 |
| 1.3.3 肺癌 |
| 1.3.4 胃癌 |
| 1.3.5 其他肿瘤 |
| 1.4 本课题研究思路 |
| 第二章 实验材料、仪器设备和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞来源和相关培养试剂 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 PCR引物 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞活性检测（CCK8方法） |
| 2.3.3 Annexin V-FITC/PI试剂食检测细胞凋亡 |
| 2.3.4 DCFH-DA探针方法检测巨噬细胞内ROS |
| 2.3.5 qRT-PCR检测巨噬细胞Il-1β和Tnf-α的表达 |
| 2.3.6 电子顺磁共振波谱(ESR)法检测ROS |
| 2.3.7 乳腺癌原位移植瘤模型建立 |
| 2.3.8 榄香烯治疗乳腺癌原位移植瘤小鼠预实验 |
| 2.3.9 治疗效果评价实验 |
| 2.3.10 生存期实验 |
| 2.3.11 统计学分析 |
| 第三章 榄香烯抗乳腺癌肿瘤活性研究 |
| 3.1 榄香烯的细胞毒性 |
| 3.2 榄香烯对乳腺癌移植瘤小鼠的治疗作用 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 榄香烯抗乳腺癌肿瘤的作用机制研究 |
| 4.1 榄香烯对肿瘤缺氧微环境的调控和抑制肿瘤血管形成与转移 |
| 4.2 榄香烯对肿瘤组织炎性微环境的影响 |
| 4.3 榄香烯对活性氧(ROS)的影响 |
| 4.3.1 榄香烯对ROS的清除作用 |
| 4.3.2 榄香烯对肿瘤组织中ROS的清除作用 |
| 4.4 榄香烯对巨噬细胞的作用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 展望 |
| 全文参考文献 |
| 附录1 非论文综述 肿瘤微环境与肿瘤细胞糖代谢 |
| 参考文献 |
| 附录2 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）HBV起源的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 CIRCRNA研究进展 |
| 1.1 CircRNAs简述 |
| 1.2 circRNAs的来源及环化机制 |
| 1.3 CircRNAs的功能 |
| 1.4 circRNAs与肝癌 |
| 1.5 病毒编码的circRNAs研究进展 |
| 2.自噬相关研究进展 |
| 2.1 自噬简述 |
| 2.2 HBV影响自噬的研究进展 |
| 2.3 CircRNAs与细胞自噬 |
| 2.4 自噬与肝癌 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究目的与内容 |
| 1.研究目的意义 |
| 2.研究内容 |
| 2.1 HBV＿circ＿1 来源及形成机制 |
| 2.2 HBV＿circ＿1 对肿瘤发生与发展的影响 |
| 2.3 HBV＿circ＿1 抑制细胞自噬及机制研究 |
| 2.4 HBV＿circ＿1 能够编码X蛋白 |
| 3.研究技术路线 |
| 第三章 HBV＿CIRC＿1 来源及形成机制 |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 cDNA制备 |
| 2.4 HBV＿circ＿1的Junction site A位点及其形成方式确认 |
| 2.5 HBV＿circ＿1 序列测定 |
| 2.6 pcDNA3.1(+)-pgRNA-eGFP质粒构建 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 基因组抽提 |
| 2.9 体外制备带有T7 启动子的RS1-eGFP-RS2 |
| 2.10 PCR验证pgRNA的正向重复序列促进环状RNA分子形成 |
| 2.11 circRNA-protein pull down筛选与pgRNA末端重复序列相互作用的蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV＿circ＿1 具有2个Junction sites、来源于HBV转录产物pgRNA |
| 3.2 pgRNA的正向重复序列可以促进环状RNA分子的形成 |
| 3.3 正向重复序列相互作用蛋白的初步筛选 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 HBV＿CIRC＿1 对肿瘤形成和发展的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞表型特征检测 |
| 2.3 肿瘤动物模型的建立 |
| 2.4 外泌体提取 |
| 2.5 外泌体、成瘤裸鼠的瘤体及其他组织中HBV＿circ＿1 的检测 |
| 2.6 苏木精—伊红染色法(HE染色) |
| 2.7 免疫组化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV＿circ＿1 促进细胞增殖 |
| 3.2 HBV＿circ＿1 促进细胞周期 |
| 3.3 HBV＿circ＿1 促进肿瘤形成与发展 |
| 3.4 HBV＿circ＿1 在瘤体及其他组织中的分布 |
| 3.5 HBV＿circ＿1 增加肿瘤的恶性程度 |
| 3.6 HBV＿circ＿1 促进瘤体中的细胞增殖和细胞周期 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 HBV＿CIRC＿1抑制细胞自噬及其机制研究 |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.0 实验试剂 |
| 2.1 调节细胞内HBV＿circ＿1 的表达 |
| 2.2 细胞蛋白收集 |
| 2.3 SDS-PAGE及 Western blotting |
| 2.4 细胞免疫荧光 |
| 2.5 MTT法检测药物毒性 |
| 2.6 免疫组化检测瘤体中p62的表达 |
| 2.7 Real-time PCR检测自噬起始复合物相关基因和PHB2 表达水平 |
| 2.8 验证HBV＿circ＿1与PHB2 的相互作用 |
| 2.9 生物信息学分析相互作用位点 |
| 2.10 pLCDH-HBV＿circ＿1-mut质粒构建 |
| 2.11 Co-IP |
| 2.12 数据分析统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 qPCR检测调节细胞内HBV＿circ＿1 表达的效率 |
| 3.2 瞬时表达HBV＿circ＿1 抑制细胞自噬 |
| 3.3 下调HepG2.2.15 细胞中HBV＿circ＿1 表达促进细胞自噬 |
| 3.4 HBV＿circ＿1 可以抵消雷帕霉素对自噬的诱导作用 |
| 3.5 HBV＿circ＿1 促进瘤体中p62 的累积 |
| 3.6 HBV＿circ＿1 对自噬起始过程相关基因的转录水平无明显影响 |
| 3.7 HBV＿circ＿1 不影响PHB2 表达 |
| 3.8 RNA pull-down和 RIP检测HBV＿circ＿1与PHB2 间相互作用 |
| 3.9 HBV＿circ＿1与LC3 竞争性结合PHB2 |
| 3.10 HBV＿circ＿1 突变体丧失对细胞自噬的抑制作用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 HBV＿CIRC＿1 编码HBx |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 分析HBV＿circ＿1 编码X蛋白的潜力 |
| 2.3 细胞水平检测HBV＿circ＿1 编码X蛋白 |
| 2.4 pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red重组质粒构建 |
| 2.5 瘤体中检测HBV＿circ＿1 编码X蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV＿circ＿1 具有编码蛋白的潜力 |
| 3.2 转染pLCDH-HBV＿circ＿1 的细胞中可检测到X蛋白 |
| 3.3 转染pLCDH-HBV＿circ＿1 细胞形成的瘤体中可检测到X蛋白 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 总结论 |
| 创新点 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 实验室常用仪器 |
| 附录三 HBV＿circ＿1序列 |
| 附录四 重组质粒序列 |
| 附录五 载体图谱 |
| 附录六 原始数据 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
（6）SPOCK1/SIX1信号轴调控乳腺癌演进的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 乳腺癌概况 |
| 1.2 SPOCK1基因基本概况 |
| 1.2.1 SPOCK1的分子结构及功能 |
| 1.2.2 SPOCK1与肿瘤 |
| 1.3 SIX1基因基本概况 |
| 1.3.1 SIX1的分子结构及功能 |
| 1.3.2 SIX1与肿瘤 |
| 1.4 上皮-间质转化(EMT)简介 |
| 1.4.1 EMT概念及特征 |
| 1.4.2 EMT相关的调节因子 |
| 1.4.3 EMT相关信号通路 |
| 1.4.4 SIX1在EMT过程中发挥的作用 |
| 1.4.5 SPOCK1在EMT过程中发挥的作用 |
| 1.5 PI3K/AKT/mTOR信号通路简介 |
| 1.5.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路及其小分子抑制剂 |
| 1.5.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路参与乳腺癌EMT过程 |
| 1.6 实验设计 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 乳腺癌细胞系及组织切片 |
| 2.1.2 主要抗体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 生物信息数据分析 |
| 2.2.3 SPOCK1慢病毒转染实验 |
| 2.2.4 MTT实验 |
| 2.2.5 EdU细胞增殖实验 |
| 2.2.6 平板克隆实验 |
| 2.2.7 流式细胞术 |
| 2.2.8 Western blot实验 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 Transwell细胞迁移、侵袭实验 |
| 2.2.11 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.12 建立裸鼠异种移植瘤模型 |
| 2.2.13 裸鼠肺转移模型的建立 |
| 2.2.14 苏木素-伊红染色(HE染色) |
| 2.2.15 S-P法免疫组织化学染色 |
| 2.2.16 免疫共沉淀实验(Co-IP实验) |
| 2.2.17 SIX1小干扰RNA细胞转染 |
| 2.2.18 数据处理与统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SPOCK1在乳腺癌中异常高表达,且患者预后不良相关 |
| 3.2 SPOCK1高表达促进乳腺癌增殖及细胞周期进程 |
| 3.3 SPOCK1可通过EMT途径促进乳腺癌转移 |
| 3.4 SPOCK1通过激活AKT/mTOR信号通路促进乳腺恶性进展 |
| 3.5 SIX1在乳腺癌中高表达,且与SPOCK1具有相互作用 |
| 3.6 SPOCK1/SIX1信号轴通过激活AKT/mTOR信号通路调节乳腺癌演进 |
| 4 讨论 |
| 5 总结与展望 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成绩 |
| 致谢 |
（7）EVs介导的乳腺癌细胞与HUVEC相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词中英文注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1.乳腺癌 |
| 1.2.血管内皮细胞 |
| 1.2.1.血管内皮细胞 |
| 1.2.2.人脐静脉内皮细胞 |
| 1.2.3.血管生成与肿瘤 |
| 1.3.胞外囊泡 |
| 1.3.1.胞外囊泡的定义和形成 |
| 1.3.2.胞外囊泡的分离方法 |
| 1.3.3.胞外囊泡与血管生成 |
| 1.3.4.胞外囊泡与肿瘤 |
| 1.3.5.胞外囊泡的治疗潜力 |
| 第二章 研究目的、方法、方案及意义 |
| 2.1.研究目的 |
| 2.2.研究方法和内容 |
| 2.2.1.乳腺癌细胞源EVs的分离和鉴定 |
| 2.2.2.乳腺癌细胞源EVs对 HUVEC生物学特性的影响 |
| 2.2.3.HUVEC-EVs对乳腺癌细胞生物学特性的影响 |
| 2.3.研究意义 |
| 第三章 乳腺癌细胞源EVs的分离和鉴定 |
| 3.1.试剂材料与仪器 |
| 3.1.1.实验细胞 |
| 3.1.2.实验试剂和耗材 |
| 3.1.3.实验仪器 |
| 3.2.相关溶液的配制 |
| 3.2.1.H-DMEM营养液(1000 ml) |
| 3.2.2.双抗的配制 |
| 3.2.3.0.25%胰酶的配制(1000 ml) |
| 3.2.4.PBS的配制(1000 ml) |
| 3.2.5.冻存液的配制(10 ml) |
| 3.3.实验方法 |
| 3.3.1.细胞的传代培养 |
| 3.3.2.细胞的冻存与复苏 |
| 3.3.3.细胞上清液的制备 |
| 3.3.4.乳腺癌细胞源EVs的分离 |
| 3.3.5.乳腺癌细胞源EVs的鉴定 |
| 3.3.5.1.透射电镜观察乳腺癌细胞源EVs形态特征 |
| 3.3.5.2.NTA粒径分析检测乳腺癌细胞源EVs大小 |
| 3.3.5.3 Western blot检测乳腺癌细胞源EVs标志蛋白 |
| 3.4.实验结果 |
| 3.4.1.乳腺癌细胞源EVs的形态学特征 |
| 3.4.2.粒径分析检测乳腺癌细胞源EVs大小 |
| 3.4.3.Western blot检测乳腺癌细胞源EVs表面标志蛋白 |
| 3.5.讨论 |
| 第四章 乳腺癌细胞源EVs对HUVEC生物学特性的影响 |
| 4.1.试剂材料与仪器 |
| 4.1.1.实验细胞 |
| 4.1.2.实验试剂和耗材 |
| 4.1.3.实验仪器 |
| 4.2.相关溶液的配制 |
| 4.2.1.MTT的配制 |
| 4.2.2.Western blot相关试剂的配制 |
| 4.2.3.AG490 抑制剂的配制 |
| 4.3.实验方法 |
| 4.3.1.乳腺癌细胞源EVs内化检测 |
| 4.3.2.MTT实验 |
| 4.3.3.平板克隆实验 |
| 4.3.4.Transwell迁移实验 |
| 4.3.5.划痕实验 |
| 4.3.6.成管实验 |
| 4.3.7.细胞蛋白的提取 |
| 4.3.8.Western blot |
| 4.3.9.统计分析 |
| 4.4.实验结果 |
| 4.4.1.乳腺癌细胞源EVs内化实验 |
| 4.4.2.乳腺癌细胞源EVs对 HUVEC增殖的影响 |
| 4.4.3.乳腺癌细胞源EVs对 HUVEC克隆形成能力的影响 |
| 4.4.4.乳腺癌细胞源EVs对 HUVEC迁移能力的影响 |
| 4.4.5.乳腺癌细胞源EVs对 HUVEC成管能力的影响 |
| 4.4.6.乳腺癌细胞源EVs对 HUVEC相关蛋白表达的影响 |
| 4.4.7.乳腺癌细胞源EVs对 AG490 抑制剂处理后HUVEC克隆形成的影响 |
| 4.4.8.乳腺癌细胞源EVs对 AG490 抑制剂处理后HUVEC迁移能力的影响 |
| 4.4.9.乳腺癌细胞源EVs对 AG490 抑制剂处理后HUVEC成管能力的影响 |
| 4.4.10.乳腺癌细胞源EVs对 AG490 抑制剂处理后HUVEC相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.讨论 |
| 第五章 HUVEC-EVs对乳腺癌细胞生物学特性的影响 |
| 5.1.试剂材料与仪器 |
| 5.1.1.实验试剂和耗材 |
| 5.1.2.实验仪器 |
| 5.2.实验方法 |
| 5.2.1.Transwell侵袭实验 |
| 5.2.2.统计分析 |
| 5.3.实验结果 |
| 5.3.1.HUVEC-EVs对乳腺癌细胞增殖的影响 |
| 5.3.2.HUVEC-EVs对乳腺癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 5.3.3.HUVEC-EVs对乳腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 5.3.4.HUVEC-EVs对乳腺癌细胞侵袭能力的影响 |
| 5.3.5.HUVEC-EVs对乳腺癌细胞相关蛋白表达的影响 |
| 5.4.讨论 |
| 第六章 主要结论与展望 |
| 6.1.主要结论 |
| 6.2.展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文、获奖及参加会议 |
| 一、发表论文情况 |
| 二、获奖情况 |
| 三、参加会议情况 |
（8）基于乳腺癌分型和炎性微环境设计的Pt（Ⅳ）前药分子的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、基于雌激素受体阳性乳腺癌的褪黑素类Pt(Ⅳ)前药分子Melatplatin的设计合成及其体内外活性机制研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验原料、试剂及仪器 |
| 1.1.2 实验原理、方法 |
| 1.2 结果与讨论 |
| 1.2.1 HPLC检测系列Melatplatin化合物纯度 |
| 1.2.2 Melatplatin化合物对ER阳性细胞的选择性杀伤作用 |
| 1.2.3 Melatplatin化合物3 有效抑制ER阳性肿瘤细胞中ER?表达 |
| 1.2.4 Melatplatin化合物3与MT受体具有更高的亲和力 |
| 1.2.5 Melatplatin化合物3在MCF-7 细胞中大量蓄积 |
| 1.2.6 Melatplatin化合物的还原性能 |
| 1.2.7 Melatplatin化合物3 导致严重的DNA损伤和细胞周期阻滞 |
| 1.2.8 Melatplatin化合物3 诱导大量肿瘤细胞凋亡 |
| 1.2.9 Melatplatin化合物3 在体内发挥高效低毒的抗癌功效 |
| 1.2.10 Melatplatin化合物3 激活机体脾脏组织的免疫反应 |
| 1.3 小结 |
| 二、基于三阴乳腺癌的酮基布洛芬类Pt(Ⅳ)前药分子Ketoplatin的设计合成及其体内外活性机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验原料、试剂及仪器 |
| 2.1.2 实验原理、方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 Ketoplatin 的在胞内释放 ketoprofen 和 cisplatin |
| 2.2.2 Ketoplatin在 MDA-MB-231 细胞展现优异的细胞毒性与协同作用 |
| 2.2.3 Ketoplatin在 MDA-MB-231 细胞内大量蓄积并形成Pt-DNA加合物 |
| 2.2.4 Ketoplatin有效抑制MDA-MB-231 细胞的侵袭转移能力 |
| 2.2.5 Ketoplatin引起严重的DNA损伤 |
| 2.2.6 Ketoplatin导致MDA-MB-231 细胞严重的S期阻滞 |
| 2.2.7 Ketoplatin诱导MDA-MB-231 细胞的大量凋亡 |
| 2.2.8 Ketoplatin在荷瘤小鼠体内发挥高效低毒的抗癌作用 |
| 2.3 小结 |
| 三、具有调节肿瘤炎性微环境的非甾体抗炎药类Pt(Ⅳ)前药分子NSAID-Pt(Ⅳ)的体内外活性机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验原料、试剂及仪器 |
| 3.1.2 实验原理、方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 NSAID-Pt(Ⅳ)在肿瘤细胞中发挥优异的细胞毒性与协同作用 |
| 3.2.2 NSAID-Pt(Ⅳ)有效抑制MCF-7 细胞的侵袭转移能力 |
| 3.2.3 Etoplatin抑制COX-2、vimentin、MMP-2,上调E-cadherin表达 |
| 3.2.4 Etoplatin在荷瘤小鼠体内发挥高效低毒的抗癌作用 |
| 3.3 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 铂(Pt):抗癌药中的传奇 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）乳腺癌外泌体TSP1促进肿瘤细胞穿过血管内皮发生转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肿瘤细胞跨血管迁移研究进展 |
| 1.2 肿瘤微环境及外泌体 |
| 1.3 TSP1蛋白研究进展 |
| 1.4 斑马鱼体内肿瘤迁移模型 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 实验材料、原理及方法 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.2 实验原理及方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 肿瘤细胞上清中含外泌体的组分增强了乳腺癌细胞的跨内皮迁移 |
| 3.2 外泌体增强乳腺癌细胞的跨内皮迁移并抑制HUVECs的成管能力 |
| 3.3 MDA-MB-231 细胞来源的外泌体抑制HUVECs的胞间连接分子的表达 |
| 3.4 肿瘤细胞外泌体来源的TSP1迁移相关的重要候选分子 |
| 3.5 肿瘤细胞外泌体来源的TSP1促进体外乳腺癌细胞的跨内皮迁移 |
| 3.6 乳腺癌细胞外泌体中的TSP1抑制血管内皮细胞胞间连接分子的表达 |
| 3.7 外泌体来源的TSP1促进斑马鱼中肿瘤细胞的迁移 |
| 3.8 结果总结 |
| 4 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间的学术成果 |
| 附录2 主要缩略词表 |
（10）糖鞘脂GM1影响乳腺上皮细胞增殖和迁移的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 糖鞘脂概述 |
| 1.2.1 糖鞘脂的发现和历史 |
| 1.2.2 糖鞘脂的结构和命名 |
| 1.2.3 糖鞘脂的分布和功能 |
| 1.2.4 糖鞘脂在癌症中的表达与功能 |
| 1.3 乳腺癌概述 |
| 1.3.1 乳腺癌发展现状 |
| 1.3.2 乳腺癌分类 |
| 1.3.3 乳腺癌与糖鞘脂 |
| 1.4 细胞接触抑制概述 |
| 1.4.1 接触抑制的发现和历史 |
| 1.4.2 接触抑制的机理 |
| 1.5 上皮间质转化概述 |
| 1.5.1 EMT过程和作用 |
| 1.5.2 EMT相关信号通路 |
| 1.6 外泌体概述 |
| 1.6.1 外泌体的结构和形成 |
| 1.6.2 外泌体与细胞迁移 |
| 1.7 本课题的立体依据及主要研究内容 |
| 1.7.1 立体依据及研究意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第二章 外源添加糖鞘脂GM1对乳腺上皮细胞增殖的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 试剂配置 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞复苏 |
| 2.2.6 细胞传代 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 人乳腺上皮细胞生长曲线检测 |
| 2.2.9 EdU细胞增殖检测 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹检测(Western blot) |
| 2.2.11 流式细胞术检测GM1 含量 |
| 2.2.12 总糖鞘脂的提取与薄层层析检测 |
| 2.2.13 外源添加GM1 处理细胞 |
| 2.2.14 EGF刺激细胞激活EGFR信号通路 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 人乳腺上皮细胞增殖检测 |
| 2.3.2 常规密度和高密度细胞增殖检测 |
| 2.3.3 常规密度和高密度细胞EGFR信号通路检测 |
| 2.3.4 常规密度和高密度细胞中GM1 的表达检测 |
| 2.3.5 外源添加GM1 对细胞增殖的影响 |
| 2.3.6 外源添加GM1对EGFR信号通路的影响 |
| 2.3.7 外源添加GM1对EGFR信号通路激活的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 内源性改变GM1表达对乳腺上皮细胞增殖的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 试剂配置 |
| 3.2.4 细胞培养 |
| 3.2.5 细胞总RNA提取 |
| 3.2.6 cDNA合成 |
| 3.2.7 PCR及质粒构建 |
| 3.2.8 B3GALT4 干扰载体构建 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR |
| 3.2.10 细胞株构建 |
| 3.2.11 Western blot蛋白质免疫印迹检测 |
| 3.2.12 流式细胞术检测GM1或Gg4 含量 |
| 3.2.13 薄层层析免疫印迹检测 |
| 3.2.14 EGF刺激细胞激活EGFR信号通路 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 B3GALT4 慢病毒表达质粒的构建 |
| 3.3.2 GM1 过表达细胞株的构建 |
| 3.3.3 检测GM1 过表达细胞株中Gg4 的表达 |
| 3.3.4 B3GALT4 慢病毒干扰质粒的构建 |
| 3.3.5 GM1 敲低细胞株的构建 |
| 3.3.6 转染细胞增殖能力检测 |
| 3.3.7 转染细胞EGFR信号通路检测 |
| 3.3.8 转染细胞EGFR信号通路激活检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 GM1 通过改变EGFR在脂筏中的分布调控细胞增殖 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 试剂配置 |
| 4.2.4 细胞培养 |
| 4.2.5 Western blot蛋白质免疫印迹检测 |
| 4.2.6 细胞脂筏区和非脂筏区蛋白分的离提取 |
| 4.2.7 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 4.2.8 OptiPrep密度梯度离心 |
| 4.2.9 免疫荧光染色检测 |
| 4.2.10 MTS检测细胞增殖 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 外源添加GM3 对细胞增殖和EGFR信号通路激活的影响 |
| 4.3.2 封闭GM1 对细胞增殖能力的影响 |
| 4.3.3 常规密度和高密度时EGFR在脂筏区和非脂筏区的分布检测 |
| 4.3.4 常规密度和高密度细胞中EGFR在糖鞘脂富集区和小窝区的分布检测 |
| 4.3.5 EGF刺激后常规密度和高密度细胞中EGFR在细胞膜上分布检测 |
| 4.3.6 外源添加GM1 处理对EGFR分布的影响 |
| 4.3.7 外源添加GM1对EGFR在糖鞘脂富集区和小窝区的分布影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 GM1对乳腺上皮迁移的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 试剂配置 |
| 5.2.4 细胞培养 |
| 5.2.5 Western blot蛋白质免疫印迹检测 |
| 5.2.6 细胞悬滴聚集检测 |
| 5.2.7细胞贴壁实验 |
| 5.2.8 Transwell细胞迁移实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 敲低和过表达GM1 对细胞形态的影响 |
| 5.3.2 敲低和过表达GM1 后细胞EMT marker的变化 |
| 5.3.3 敲低和过表达GM1 后细胞粘附能力的变化 |
| 5.3.4 敲低和过表达GM1 后对细胞迁移能力的影响 |
| 5.3.5 敲低和过表达GM1对TGF-β诱导发生EMT的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 GM1对癌细胞来源的外泌体促进受体细胞迁移的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 试剂配置 |
| 6.2.4 细胞培养 |
| 6.2.5 流式检测细胞GM1 的表达 |
| 6.2.6 Western blot蛋白质免疫印迹检测 |
| 6.2.7 Transwell细胞迁移实验 |
| 6.2.8 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理MCF-10A细胞 |
| 6.2.9 MDA-MB-231和MCF-7 共培养体系建立 |
| 6.2.10 MDA-MB-231 细胞来源外泌体的提取 |
| 6.2.11 外泌体标志物检测 |
| 6.2.12 外泌体粒径检测 |
| 6.2.13 外泌体电镜拍照 |
| 6.2.14 外泌体密度梯度离心 |
| 6.2.15 外泌体处理MCF-10A细胞 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理对受体细胞GM1 含量的影响 |
| 6.3.2 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理对MCF-10A细胞EMT的影响 |
| 6.3.3 MDA-MB-231和MCF-7 细胞共培养体系中MCF-7 细胞EMT变化检测 |
| 6.3.4 外泌体质量检测 |
| 6.3.5 外泌体GM1 的表达检测 |
| 6.3.6 两种细胞来源的外泌体GM1 表达差异检测 |
| 6.3.7 MCF-10A细胞摄入外泌体检测 |
| 6.3.8 外泌体处理对MCF-10A细胞EMT的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
四、细胞外基质蛋白1对MCF-7和HUVEC增殖影响的研究（论文参考文献）
- [1]中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究[D]. 程国荣. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [2]尤文肉瘤临床预后模型的建立与肿瘤进展的机制研究[D]. 何韶辉. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响[D]. 张彦收. 河北医科大学, 2021(02)
- [4]榄香烯对三阴性乳腺癌小鼠的治疗效果与作用机制研究[D]. 韩博. 北京协和医学院, 2020(02)
- [5]HBV起源的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制及功能研究[D]. 梁子. 苏州大学, 2020(06)
- [6]SPOCK1/SIX1信号轴调控乳腺癌演进的机制研究[D]. 徐明. 延边大学, 2020(05)
- [7]EVs介导的乳腺癌细胞与HUVEC相互作用机制研究[D]. 陈宇斐. 江苏大学, 2020(02)
- [8]基于乳腺癌分型和炎性微环境设计的Pt（Ⅳ）前药分子的研究[D]. 宋雪晴. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]乳腺癌外泌体TSP1促进肿瘤细胞穿过血管内皮发生转移的机制研究[D]. 岑峻宇. 华中科技大学, 2020
- [10]糖鞘脂GM1影响乳腺上皮细胞增殖和迁移的研究[D]. 卓定浩. 江南大学, 2019(05)