一、Ad/CMV-hTGF-β1 Treats Rabbit Intervertebral Discs Degeneration in Vivo（论文文献综述）
陈晓辉[1]（2017）在《Smad3和Smad7在大鼠椎间盘退变过程中的表达及相关性分析》文中研究表明背景和目的颈椎病、椎管狭窄、腰腿疼痛等椎间盘退变性疾病（degenerative disc disease,DDD）发病率极高,并且具有明显的增加趋势,解剖学研究表明成年人尸体83%95%存在椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）。IVDD主要受年龄、遗传、力学、免疫等因素的影响,并最终导致椎间盘内部分子生物特性的改变如细胞凋亡、细胞外基质改变等。白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子在IVDD中的作用有着广泛的研究,而Smad3和Smad7作为TGF-β信号在细胞内的传导介质,关于其在IVDD中的作用的研究相对较少。本实验通过建立动物模型,检测退变椎间盘中Smad3、Smad7的表达情况,观察其在IVDD过程中的变化,分析研究其与IVDD的关系,从而为防治DDD提供新的思路和方法。材料和方法选择成年健康雄性无特定病原体（SPF）级SD大鼠60只,随机分为实验组和对照组,每组再分为1个月、3个月、5个月三个观察阶段,每组每个阶段10只。实验组采用动静力失衡大鼠颈椎椎间盘退变模型,横向切断附着于棘突及椎板的肌肉,然后依次切除颈2至颈7棘突、棘上和棘间韧带,直接缝合;对照组采用假手术处理,仅切开皮后直接缝合。分别于1个月、3个月、5个月时处死大鼠,取出颈椎椎间盘;采用HE染色观察分析IVDD程度;采用免疫组织化学法检测Smad3和Smad7蛋白的表达;采用RT-PCR技术检测Smad3和Smad7m RNA表达。数据采用SPSS21.0软件进行统计分析。结果1.一般情况:在实验过程中实验组大鼠1月死亡2只,2月死亡1只,对照组1月死亡1只。2.大鼠椎间盘组织学评分:实验组三个阶段椎间盘组织学评分分别为（1.67±1.23、3.56±1.13、4.44±0.88）高于对照组（0.56±0.73、0.78±0.83、1.22±0.97）,差异有统计学意义（P<0.05）;实验组大鼠椎间盘细胞数目普遍少于对照组并且排列不整齐,纤维环出现纤维排列不整齐,纤维环和髓核边界模糊,板层结构出现裂隙,髓核胶样结构内脊索细胞丢失,软骨样细胞增多,髓核粘液样变,裂隙形成等,椎间盘内出现成骨反应,上述情况随时间增加而加重;对照组椎间盘纤维环及髓核细胞排列相对整齐,裂隙、粘液样变、成骨反应较轻,三个阶段差异较小。3.大鼠椎间盘Smad3、Smad7蛋白表达情况:实验组三个阶段Smad3蛋白的表达（22.90±2.72、33.52±4.99、46.48±10.42）均高于对照组（18.13±3.09、19.06±5.06、20.96±3.38）,差异有统计学意义（P<0.05）;实验组三个阶段Smad7蛋白的表达（18.61±7.52、42.68±15.50、24.46±9.20）均高于对照组（11.44±3.75、14.46±6.43、15.08±6.31）,差异有统计学意义（P<0.05）;实验组1、3、5个月Smad3蛋白各阶段表达差异均有统计学意义（P<0.05）,实验组Smad7蛋白1月和3月、3月和5月表达差异有统计学意义（P<0.05）;实验组Smad7蛋白1月和5月表达及对照组Smad3、Smad7蛋白各阶段表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。4.大鼠椎间盘Smad3、Smad7 m RNA表达情况:实验组三个阶段Smad3 m RNA表达（0.441±0.111、0.532±0.153、0.794±0.090）均高于对照组（0.346±0.101、0.409±0.122、0.413±0.114）,差异有统计学意义（P<0.05）;实验组三个阶段Smad7 m RNA表达（0.351±0.124、0.610±0.206、0.430±0.165）均高于对照组（0.181±0.066、0.208±0.072、0.223±0.089）,差异有统计学意义（P<0.05）;实验组1月和5月、3月和5月Smad3 m RNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）,实验组Smad3 m RNA 1月和3月及对照组各阶段表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;实验组Smad7 m RNA 1月和3月、3月和5月表达差异有统计学意义（P<0.05）,实验组Smad7 m RNA 1月和5月表达及对照组各阶段表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。5.大鼠椎间盘组织学评分及Smad3、Smad7表达情况相关性分析:大鼠椎间盘Smad3蛋白和m RNA表达与组织学评分关联系数分别为r=0.527、r=0.640,两者呈正相关,有统计学意义（P<0.05）;Smad7蛋白和m RNA表达与椎间盘组织学评分相关系数分别为r=0.118、r=0.276,无统计学意义（P>0.05）;Smad3和Smad7蛋白表达相关系数为r=0.203,无统计学意义（P>0.05）;Smad3和Smad7 m RNA表达相关系数为r=0.249,无统计学意义（P>0.05）;椎间盘中Smad3的表达与椎间盘退变呈正相关,而Smad7的表达随着椎间盘退变的加重及Smad3表达的增高先增高后又呈现下降趋势。结论1.Smad3在退变的椎间盘中呈高表达状态,其表达与IVDD程度呈正相关。2.Smad7在退变的椎间盘中呈高表达状态,其表达随IVDD加重先呈增高趋势后呈下降趋势。3.Smad3和Smad7在IVDD过程中无明确的相关性,但Smad7的表达随着Smad3的表达先呈增高趋势后呈下降趋势,两者在IVDD中的表达不仅只受对方的反馈调节。4.调节Smad3和Smad7在椎间盘中的表达可能为IVDD的防治提供新的方法。
李喜功[2]（2011）在《人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的实验研究》文中提出第一部分人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养目的:探讨人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养方法。方法:收集15例人退变椎间盘髓核组织,采用0.025%的Ⅱ型胶原酶与0.004%脱氧核糖核酸酶Ⅱ消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,观察髓核细胞的类软骨表型的表达。结果:采用0.025%的Ⅱ型胶原酶加0.004%的脱氧核糖核酸酶Ⅱ4℃过夜消化可较好的分离培养出人退变椎间盘髓核细胞;原代髓核细胞平均7天贴壁,细胞呈类圆形或多角形,细胞95%融合所需时间约4周;聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达于分离培养的髓核细胞,被甲苯胺蓝染成天蓝色,Ⅱ型胶原染色为黄褐色。结论:采用0.025%的Ⅱ型胶原酶加0.004%的脱氧核糖核酸酶Ⅱ消化法体外成功培养出髓核细胞;髓核细胞呈类软骨表型,合成分泌聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白。第二部分人骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及其诱导分化目的:体外分离培养、鉴定人骨髓间充质干细胞,并检测其多向分化潜能。方法:取正常成人骨髓,应用密度梯度离心法与贴壁培养法分离、纯化人骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,倒置显微镜观察细胞形态特征;流式细胞仪检测细胞表面抗原,并利用成骨诱导剂、成脂诱导剂、成软骨诱导剂诱导人骨髓间充质干细胞向成骨、成脂、成软骨方向分化,碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、油红O染色、Safranin’O-Fast Green染色、阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学法检测其定向分化。结果:培养的细胞呈长梭形外观;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD90表达阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达阴性。细胞经过诱导液诱导14天后,碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、油红O染色、Safranin’O-Fast Green染色、阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原染色阳性。结论:通过密度梯度离心法与贴壁培养法可大量扩增、纯化人骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能。第三部分人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养下的相互影响目的:研究体外人退变髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）与骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMMSCs）共培养时,NPCs对BMMSCs的诱导分化效应,以及BMMSCs对NPCs生物活性的影响。方法:取第3代的BMMSCs与第1代NPCs在Transwell板中共培养,建立3个细胞培养组,BMMSCs与NPCs共培养组,BMMSCs单独培养组和NPCs单独培养组。分别于共培养4、8、12天后检测细胞培养上清液中转化生长因子β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）的含量变化以及BMMSCs与NPCs的增殖能力;采用RT-PCR法检测不同培养时间点BMMSCs与NPCs的I、Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表达变化。倒置显微镜观察共培养后BMMSCs及NPCs的形态学变化。结果:从第4天起,共培养组上清液中TGF-β1、IGF、PDGF的含量较BMMSCs单独培养组、NPCs单独培养组显着增高（P<0.05）,且随培养时间的延长而逐渐增加。共培养组中BMMSCs与NPCs细胞数量较BMMSCs单独培养组、NPCs单独培养组明显增多（P<0.05）。从第4天开始的各个时间点,共培养组NPCs的聚集蛋白聚糖Aggrecan、Sox-9基因表达较单独培养组高（P<0.05）,并且Ⅱ型胶原在第12天的表达也显着高于单独培养组（P<0.05）;同时从第8天起至第12天,共培养组BMMSCs的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖Aggrecan、Sox-9基因的表达较单独培养组高（P<0.05）。共培养12d后,BMMSCs及NPCs形态未见有明显变化。结论:骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养时,骨髓间充质干细胞在髓核细胞营造的微环境下向类髓核细胞转化;骨髓间充质干细胞可通过分泌TGF-β1、IGF、PDGF等细胞因子发挥其营养效应,激活髓核细胞,促进其增殖及细胞外基质的合成。第四部分TGF-β1对不同程度退变椎间盘的髓核细胞生物活性的影响目的:采用外源性转化生长因子β1（TGF-β1）模拟骨髓间充质干细胞的营养效应,探讨该营养效应对不同程度退变椎间盘的髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs）生物学活性的影响。方法:取Ⅱ、Ⅲ、IV度退变椎间盘标本各2例体外培养髓核细胞,建立Ⅱ度退变组、Ⅲ度退变组、IV度退变组及各自的对照组。实验组均给予10ng/ml TGF-β1干预,于第4天检测NPCs的增殖能力;采用荧光定量PCR法检测NPCs的I、Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表达变化;Western-blot蛋白印迹分析鉴定蛋白聚糖和p53蛋白在各组NPCs中的表达;β-半乳糖苷酶染色观察NPCs衰老情况。结果:经TGF-β1干预4天后,各退变组NPCs数量皆有不同程度的增加,但Ⅱ度退变组NPCs数量较Ⅲ、IV度退变组增加显着（P<0.05）。TGF-β1干预前各退变组NPCs I型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖Aggrecan及Sox-9基因表达未见明显差异。TGF-β1干预4天后,各退变组NPCs的基因表达显着增加,但Ⅱ度退变组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及Sox-9基因表达较Ⅲ、IV度退变组NPCs增加显着（P<0.05）。Western-blot检测也显示Ⅱ度退变组NPCs蛋白聚糖合成显着优于Ⅲ、IV度退变组（P<0.05）。β-半乳糖苷酶染色显示Ⅲ、IV度退变组NPCs衰老发生率明显高于Ⅱ度退变组NPCs（P<0.05）。p53蛋白在Ⅲ、IV度退变组中的表达也明显高于Ⅱ度退变组（P<0.05）。Ⅲ度退变组与IV度退变组之间未见明显差异。结论:一定浓度的TGF-β1能够激活退变髓核细胞,促进其增殖及细胞外基质的合成。但椎间盘退变程度可通过影响髓核细胞的生物学表型,影响TGF-β1干预的效果。这表明椎间盘退变程度可影响骨髓间充质干细胞植入后所分泌的TGF-β1的营养效应,由此影响骨髓间充质干细胞移植治疗的效果。
LIU Yong, KONG Jie, CHEN Bo-hua and HU You-gu Department of Orthopaedic Surgery, Affiliated Hospital of Medical College, Qrngdao University, Qingdao, Shandong 266003, China[3]（2010）在《Combined expression of CTGF and tissue inhibitor of metalloprotease-1 promotes synthesis of proteoglycan and collagen type Ⅱ in rhesus monkey lumbar intervertebral disc cells in vitro》文中指出 Background Low back pain has emerged as a widespread disease often caused by intervertebral disc degeneration.This study aimed to establish an in vitro cell culture model of rhesus monkey lumbar intervertebral discs and toinvestigate the effect of combined connective tissue growth factor （CTGF） and tissue inhibitor of metalloprotease-1（TIMP-1） expression mediated by adeno-associated virus （AAV） on collagen type Ⅱ and proteoglycan levels. The purposeof these investigations was to explore potential methods for relieving the degeneration of lumbar intervertebral disc cells.Methods Rhesus monkey lumbar intervertebral disc nucleus pulposus cells （NPCs） were isolated by enzyme digestion,cultured, and transduced with rAAV2-CTGF-IRES-TIMP-1, rAAV2-CTGF, or rAAV2-TIMP-1 at a multiplicity of infection（MOI） of 106. The expression of collagen type Ⅱ and proteoglycan was measured using RT-PCR and Western blotting.The synthetic rate of proteoglycan was measured using 35S incorporation.Results Rhesus monkey lumbar intervertebral disc NPCs were transduced with rAAV2-CTGF-IRES-TIMP-1,rAAV2-CTGF, and rAAV2-TIMP-1 and the transduced genes were expressed and detected. Compared to the control,CTGF promoted the synthesis of collagen type Ⅱ and proteoglycan. TIMP-1 showed an enhancing effect on theexpression of proteoglycan but no effect on collagen type Ⅱ. Expression of both genes in rhesus monkey lumbarintervertebral disc NPCs significantly enhances the synthesis of proteoglycan and collagen type Ⅱ.Conclusions Single gene transduction of CTGF or TIMP-1 can enhanced synthesis of proteoglycan. CTGF expressioncan also enhance collagen type Ⅱ protein synthesis. Combined transduction of both CTGF and TIMP1 can significantlypromote the expression of proteoglycan and collagen type Ⅱ to levels greater than transduction of a single gene alone.Our study provides a good basis for multi-gene therapy to treat lumbar intervertebral disc degeneration.
王超锋[4]（2010）在《异体椎间盘复合表达外源性hBMP7因子的髓核细胞构建组织工程椎间盘的实验研究》文中提出椎间盘退变是引起成人腰腿痛、颈肩痛的主要原因。随着人均寿命的延长和社会工作压力增大,椎间盘退变性疾病的发病率明显升高,而目前的保守治疗和外科手术治疗均不能从根本上,解决患者的病情。通过动物实验及临床初步应用证明,椎间盘移植后可以异体存活,并能完全缓解患者的临床症状,就其生物力学方面亦可满足生理活动需要,但植入的异体椎间盘在生化代谢及组织学上有明显的退行性改变,这将导致临床症状的再次出现,并可能出现椎间盘活动度消失等并发症。最近的研究结果显示椎间盘内细胞活性的提高能延缓甚至阻止椎间盘退变性改变。因此本实验拟通过以异体椎间盘为支架材料,以表达外源性人BMP7的髓核细胞为种子细胞,体外构建组织工程椎间盘,并观察组织工程椎间盘的生物活性及功能情况。1.深低温储存温度及时间对异体椎间盘生物活性的影响目的:探讨不同的深低温储存温度及储存时间对异体椎间盘生物活性影响,获得最适合临床应用的保存条件。方法:取犬椎间盘52只,分为对照组、液氮保存组和-80℃保存组。在冷冻保存液中分别储存于液氮及-80℃低温冰箱中,在储存的2w、1m、2m、4m、6m及12m时,通过EB/FAD法检测椎间盘组织中不同部位的细胞存活率,以DMMB法检测髓核组织蛋白多糖（PG）含量,以羟脯氨酸法检测髓核组织中的总胶原含量。结果:各检测时间点两组间外层纤维环细胞活性明显高于内层纤维环及髓核组织（p<0.05）,内层纤维环及髓核组织间细胞活性未见明显不同;在内层纤维环及髓核组织中,细胞存活率在储存2w时,可见液氮组明显高于-80℃组（p<0.05）,自储存1月起至12个月,两组间均无明显差别（p>0.05）。在储存期间两储存组蛋白多糖含量均逐渐降低,在1m至12m储存期间,液氮保存组蛋白多糖含量均高于-80℃保存组。而两组间总胶原蛋白含量在储存期间随时间逐渐降低,但两组间未见明显差异。结论:利用液氮保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃,1年的液氮保存期间,细胞存活率及功能蛋白PG含量均在一个恒定的水平,能满足异体椎间盘移植的基本要求,可作为组织工程椎间盘的支架材料。2.重组腺相关病毒人BMP7（rAAV2-hBMP7）病毒载体的构建及鉴定目的:探讨能否利用pSNAV2.0质粒构建系统构建pSNAV2.0-hBMP7穿梭质粒,并包装纯化成可供实验用rAAV-hBMP7病毒载体。方法:利用AgeI和NheI酶切pDC316-hBMP7-IRES-EGFP质粒,回收纯化hBMP7基因片段,以AgeI和NheI酶切载体质粒pSNAV2.0-LacZa,回收纯化pSNAV2.0载体质粒片段,利用T4 DNA连接酶将纯化回收的hBMP7基因与pSNAV2.0载体质粒片段连接构建,并转化入感受态大肠杆菌DH-5α进行扩增纯化,测序鉴定;用Lipofectamine 2000将序列正确的pSNAV2.0- hBMP7质粒转染至BHK-21细胞,G418选择培养,并大量扩增至所需并用HSV1-rc/ΔUL2辅助病毒感染,以PEG8000/NaCl沉淀,以氯仿纯化浓缩、检测滴度及纯度。结果:成功构建了pSNAV2.0- hBMP7质粒,经PCR、酶切和测序鉴定构建正确。利用Lipofectamine 2000将序列正确的pSNAV2.0- hBMP7质粒转染至BHK-21细胞,并通过含有G418的培养基,选择性扩增,并浓缩纯化出了滴度达5.1×1011 v.g、纯度>97%的rAAV-hBMP7病毒载体。结论:利用pSNAV2.0质粒包转系统能成功将外源性基因hBMP7包装成滴度及纯度满足实验要求的rAAV-hBMP7病毒载体。3.介导人骨形成蛋白-7的2型腺相关病毒转染髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响目的:以介导外源性人骨形成蛋白-7（hBMP7）基因的2型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus type-2,rAAV2）载体转染犬髓核细胞（canine nucleus pulposus cell, cNP cell）,观察转染后髓核细胞hBMP7蛋白表达,并分析髓核细胞生物功能变化。方法:实验组以最佳感染复数（MOI）1×105 vg/cell转染犬髓核细胞,对照组以相同MOI的不含hBMP7基因的rAAV2-EGFP病毒感染。在转染后4d、7d和14d分别以RT-PCR、Wenstenbloting方法分别对两组髓核细胞中hBMP7的mRNA转录及蛋白表达进行检测。在转染后的第7天,检测两组细胞增殖能力。在转染后的4、7和14d,利用real-time PCR、DMMB及Elisa法分别检测蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ胶原的mRNA含量、蛋白多糖含量及Ⅰ和Ⅱ型胶原蛋白含量。结果:在以1×105 vg/cell转染犬髓核细胞后,在4d、7d和14d时均可检测到实验组髓核细胞中高表达hBMP7 mRNA,而对照组,无论在何时间点均不能检测到hBMP7 mRNA的转录,半定量分析显示,7d时mRNA含量较高。Westenbloting蛋白检测结果显示:7d、14d时,实验组均可检测到分子量为55kd特异性hBMP7蛋白的表达,而对照组均未观察到阳性蛋白条带。半定量分析显示:转染后7d时hBMP7蛋白含量相对较高。在转染7天后,转染组与未转染组细胞增殖能力未见明显区别。对实验组髓核细胞的Real-time PCR定量分析发现:蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA在转染后第4天无明显增加,但在第7天和14天均明显增高。而Ⅰ型胶原mRNA在4、7和14天均未见明显变化。实验组蛋白多糖含量第4天未见明显变化,而第7、14天较对照组分别增高42%及77%。而Ⅰ胶原含量两组间未见明显增加,实验组Ⅱ型胶原含量在第4天未见明显增加,而第7、14天分别较对照组增高63%及94%。结论: rAAV2-hBMP7病毒载体能有效地转染犬髓核细胞并长期稳定表达人骨形成蛋白-7,并能提高犬髓核细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量,这将能为组织工程椎间盘提供可选择的基因修饰的种子细胞。4.组织工程椎间盘的体外构建目的:探讨利用液氮储存异体椎间盘及表达外源性人BMP7的髓核细胞体外构建组织工程椎间盘的方法方法:取储存于液氮中2个月的犬椎间盘24只,分为EGFP对照组、1×104、1×105和1×106四组,每组6只。对照组用16G注射器自椎间盘后正中注入1×105的表达EGFP的髓核细胞20ul, 1×104组注入PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul,其总细胞数为1×104,1×105组为总细胞数1×105的PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul,1×106组为细胞总数1×106的PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul。注射后立即置入50ml离心管中,加入30ml完全培养基,分别于培养4、7、14天,从椎间盘形态、细胞存活、及髓核细胞荧光强度、蛋白多糖及胶原含量等方面进行评价。结果:在储存的第4天及7天,椎间盘外形基本未见明显改变,而在储存至14天时,可见椎间盘上下终板有钙质脱落。在各时间点均可见表达绿色荧光蛋白髓核细胞。对不同组、不同时间点的组织工程椎间盘中荧光强度定量后发现:培养第7和14天时,1×105组荧光强度明显高于1×106组和1×104组。而且1×105组培养第7和14天时蛋白多糖及总胶原含量均较另外三组明显增高。结论:利用液氮储存异体椎间盘同1×105转染髓核细胞复合,体外培养7天能构建出较理想的组织工程椎间盘。小结:1.利用液氮保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃,1年的液氮保存期间,细胞存活率及功能蛋白PG含量均在一个恒定的水平,能满足异体椎间盘移植的基本要求,可作为组织工程椎间盘的支架材料。2.利用pSNAV2.0质粒包转系统能成功将外源性基因hBMP7包装成滴度及纯度满足实验要求的rAAV-hBMP7病毒载体。3. rAAV2-hBMP7病毒载体能有效地转染犬髓核细胞并长期稳定表达人骨形成蛋白-7,并能提高犬髓核细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量,这将能为组织工程椎间盘提供可选择的基因修饰的种子细胞。4.利用液氮储存异体椎间盘同1×105转染髓核细胞复合,体外培养7天能构建出生物活性较高组织工程椎间盘。这将能被用于进一步动物实验,以研究组织工程椎间盘的生物活性。
丁涛[5]（2010）在《丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在肺栓塞动物模型及椎间盘藻酸盐凝胶培养系统中的实验测试研究》文中研究指明第一部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥的制备、抗稀散性及体外凝血实验研究【目的】制备丝素蛋白/磷酸钙骨水泥（silk fibroin/calcium phosphate cement,SF/CPC）复合人工骨材料,对骨水泥在液体中的抗稀散性进行测试,试验不同SF添加质量分数对稳定性的影响,同时测试PMMA、CPC和SF/CPC对离体动物血浆凝血指标的影响,为下一部分的动物体内实验提供参照。【方法】将家蚕丝纤维脱胶、溶解、透析、喷雾干燥后制得丝素蛋白粉末。通过液相沉淀法制备磷酸四钙,将其和无水磷酸氢钙等摩尔比混合,加入4 wt%羟基磷灰石晶种。配制质量分数分别从0.5 wt%、1.0 wt%、1.5 wt%、2.0 wt%、2.5 wt%到3.0 wt%的丝素复合磷酸钙骨水泥6组,按液固比0.4ml/g与固化液混合,制备6种SF/CPC,未添加SF的CPC组作为空白对照。观察各种材料在液体中的抗稀散性,定量测定骨水泥残余质量百分比。将固化后的PMMA、CPC和SF/CPC骨水泥材料颗粒加入新鲜猪血浆,测定材料对凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原定量（Fig）及D-二聚体（D-D）等凝血指标的影响。【结果】由于SF的添加,CPC在液体中的抗稀散性明显提高,随着SF质量分数的提高,SF/CPC的骨水泥残余率逐渐上升,至2.5wt%-3.0wt%时基本达到100%。三种骨水泥作用动物血浆后仅CPC组的PT略有减少,其它凝血指标未见明显改变。【结论】丝素蛋白的添加可以明显改善磷酸钙骨水泥在液体中易崩解的特性,SF/CPC的抗稀散性与添加SF的质量分数有同增关系,兼顾稳定性与注射性,选择2.5wt%的SF/CPC进行后续的研究。骨水泥材料对体外血浆的凝血指标影响很小,仅观察到CPC使PT有轻微的缩短,丝素的添加可进一步提高CPC的血液相容性。第二部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在骨水泥肺栓塞动物模型中的测试研究【目的】建立骨水泥肺栓塞动物模型,研究PMMA、CPC及SF/CPC三种材料造成肺栓塞后,对心血管系统的血流动力学、肺氧合及抗凝血酶活性的影响,探讨丝素改良骨水泥材料降低心血管系统并发症的可行性。【方法】实验动物麻醉后气管插管,呼吸机保持正常的呼气末潮气量和动脉CO2浓度。下肢股动脉置入测压管,供监测有创动脉血压和采集血标本;经颈内静脉置入肺动脉漂浮导管测量肺动脉压及中心静脉压。动物行开胸手术,经肺动脉干注入PMMA、CPC或SF/CPC骨水泥,持续监测血流动力学参数,包括平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure,MPAP）、平均动脉压（mean arterial pressure,MABP）、中心静脉压（central venous pressure,CVP）和心率（heart rate,HR） ;测定预设时间点的动脉血PH值、动脉血氧分压（PaO2）和动脉血二氧化碳分压（PaCO2）以及注射前后抗凝血酶Ⅲ活性（ATⅢ）。处死后肺标本行CT检查,立体三维重建血管内骨水泥铸形。【结果】CPC对心血管系统的影响最为严重,平均肺动脉压的升高最大时为21.33±5.44mmHg（注射后50分钟）,平均动脉压下降最大时为-27.15±11.79mmHg（注射后50分钟）,在注入骨水泥10分钟时出现心率的瞬时下降（-27.67±6.14次/分）。PMMA组及SF/CPC组的变化较轻微,与CPC组比较差异有统计学意义。注射骨水泥后CPC组血气指标改变明显,PH值下降,变化最大时-0.13±0.02（注射后60分钟）,动脉血二氧化碳分压（PaCO2）升高,变化最大时15.9±7.67mmHg（注射后60分钟）,注射后10分钟动脉血氧分压（PaO2）即已有明显下降（-23±1.26mmHg）; PMMA及SF/CPC对肺栓塞动物动脉血气的影响较小。AT-III在三组均有下降,CPC组降幅最大,与另两组间差异有统计学意义。【结论】注射型骨水泥直接注入动物肺动脉干可建立椎体成形术中骨水泥血管渗漏致肺栓塞模型,对PMMA、CPC及丝素复合CPC三种材料进行的测试比较结果证明,骨水泥的抗稀散性对肺栓塞后心血管并发症严重程度起主要影响作用。丝素的复合使CPC在血液中的抗稀散性明显提高,有效地减少了栓子特别是微栓子的产生,能明显减轻骨水泥栓塞后对血流动力学、呼吸功能的影响,降低激活凝血系统的危险,从而降低急性心肺功能障碍的发生率和死亡率。第三部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥对藻酸盐凝胶培养系统中椎间盘细胞活性、基质多糖及胶原代谢影响的实验研究【目的】研究PMMA、CPC和SF/CPC三种骨水泥材料浸出培养液对藻酸盐凝胶培养系统中椎间盘细胞活性、基质多糖和胶原代谢的影响。【方法】兔椎间盘标本取出后,在藻酸盐凝胶系统中分别使用常规培养液（对照组）、PMMA、CPC及SF/CPC材料浸出培养液培养,至1周、2周及3周时,对各组标本行Hoechst33342和PI染色检测细胞坏死率,免疫组化检测I型胶原、Ⅱ型胶原的表达,番红O（Safranin O）染色检测基质蛋白多糖含量。在荧光显微镜下计数Hoechst33342和PI染色切片中强红色荧光+强蓝色荧光重叠的细胞数占总细胞数的百分比;利用Image-pro plus 6.0软件对免疫组化I型胶原、Ⅱ型胶原染色切片中棕黄色阳性沉淀及番红O染色切片中番红色部分作平均光密度（IOD/Area）分析。【结果】各周PMMA组及CPC组坏死细胞率均高于对照组及SF/CPC组,第一周时SF/CPC组坏死细胞率明显低于PMMA组和CPC组（P<0.05）,第三周时SF/CPC组坏死细胞率与PMMA组无统计学差异,但明显低于CPC组（P<0.05）。纤维环外层Ⅰ型胶原光密度测定结果显示,第一周时PMMA组光密度值明显低于其他组,第二周、第三周时CPC组及SF/CPC组较对照组有升高。纤维环内层及髓核区II型胶原光密度测定结果显示,第二周时,PMMA及CPC组明显低于SF/CPC组和对照组,SF/CPC组近似于对照组。Safranin O染色光密度结果显示,对照组平均光密度值随时间呈下降趋势,PMMA组基质多糖含量下降最早且最为明显。【结论】PMMA对藻酸盐凝胶系统中培养的椎间盘细胞活性、基质胶原及多糖代谢影响最为明显,SF/CPC较CPC对椎间盘组织有更好的生物相容性,对椎间盘代谢的干扰最小。椎体成形术所用骨水泥材料可加速椎间盘的退变,影响程度与材料的类型有关,选择适当的填充材料可降低此并发症的发生率。第四部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥对椎间盘基因表达影响的实验研究【目的】研究骨水泥材料对椎间盘退变相关基因表达的影响,从基因水平分析椎体成形术后椎间盘退变的机理,为预防和治疗措施提供靶基因及作用机制等理论基础。【方法】建立藻酸盐凝胶系统对兔椎间盘进行体外培养,分别以常规培养液（对照组）、PMMA、CPC及SF/CPC材料的浸出培养液培养,至1周、2周时提取各组标本RNA行PCR扩增和产物检测以及SYBR? Green I荧光定量PCR检测,对AGC1、COLⅠ、COLⅡ、BMP-2、IL-1β、TIMP-1、MMP-3、MMP-2、SOX-9、TGF-β1、Cox-2在各组的表达水平进行比较,通过内标基因GAPDH和对照组基因对目的基因进行校正,2-△△CT法估算目的基因的相对表达量。【结果】第一周时PMMA组AGC1的表达量低于对照组,CPC组及SF/CPC组均高于对照组,第二周时SF/CPC组表达量仍保持较高水平;各骨水泥组COL1的表达量在第一周时较对照组均有反应性的调高,第二周回落仅SF/CPC组表达量仍能保持与对照组接近;各骨水泥组COL2基因表达在第一周时均未测出,第二周时虽可测出但均极低;第一周时PMMA组及CPC组MMP-2、MMP-3的表达量均高于对照组,第二周时CPC组表达量下降,SF/CPC组表达则始终低于对照组;第一周时PMMA组和CPC组的TIMP-1的表达量增高,第二周时各组表达量较第一周时均有下降;各骨水泥组IL-1β的表达在第一周及第二周均高于对照组,第二周时SF/CPC组的表达低于PMMA组和CPC组;CPC组COX-2的表达量高于其他组;第一周时大部分骨水泥组TGF-β1、BMP-2及SOX9表达量高于对照组,第二周时均有不同程度的下降,TGF-β1和SOX9的表达低于对照组。【结论】骨水泥材料对椎间盘退变相关基因表达量有影响,能促使体外培养的椎间盘退变,但椎间盘组织本身的保护和修复机制也有相应的反应性激活。不同类型的材料对特定基因表达的影响存在差异,PMMA和CPC使COL1基因表达短暂反应性增高后降至正常对照以下,而SF/CPC作用下COL1基因的表达仍能保持一定水平, PMMA对AGC1的表达抑制作用强,SF/CPC未引起基质降解相关基因MMP-2和MMP-3的表达上升,对炎症因子基因表达增高的刺激作用较PMMA和CPC组小。在影响基因表达水平上,SF/CPC促椎间盘退变的作用最小。
李朝顶[6]（2010）在《脊索细胞与椎间盘退变的相关性研究》文中研究说明第一部分:兔腰椎间盘退变模型建立目的:纤维环损伤诱导椎间盘退变建立实验动物模型。方法:新西兰大白兔12只年龄2岁左右,体重2.0-3.5KG左右,雌雄不限。2只作为正常对照未行手术,其余10只进行手术制造椎间盘退变模型。手术采用10%水合氯醛3ml/kg耳缘静脉注射麻醉、备皮、碘伏消毒、铺巾。采用腰椎背侧纵切口,椎旁肌腹侧2cm,从胸廓下缘2cm至骨盆环,脊柱L1-L6左前外侧被暴露,钝性分离椎前软组织,骨盆环作为L5/6间隙的标志。用18G针头分别在L2/3、L4/5椎间盘进行穿刺,L3/4和L5/6作为自身对照。术后2、4、8、16、32周各随机选取2只兔,行脊柱MRI检查并行免疫组化及组织学观察。结果:术后第3～10周造模后的椎间盘MRI T2WI信号呈现持续减弱趋势,而内对照非手术节段髓核信号强度在观察期内无明显变化。各组椎间盘分级分值的变化显示,从术后2周开始,穿刺椎间隙与自身内对照椎间隙比较差异均有统计学意义（P < 0.05）;穿刺髓核MRI T2相信号呈进行性下降,至术后16周呈快速下降。免疫组化及组织学观察发现髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较对照间盘进行性减少（P<0.01）。结论:纤维环穿刺诱导兔椎间盘退变的动物模型能再现IDD发展的客观规律而且模型制作简单、重复性好。第二部分:不同年龄组兔椎间盘细胞分布类型研究目的:分析脊索细胞和软骨样细胞细胞形态及随年龄增长时的分布情况方法:取3月龄组和3年龄组新西兰大白兔各5只,完整取出腰椎脊柱,兔腰椎椎间盘纤维环横行切开,完整取出髓核,放入petri培养皿,PPS洗液调制PH7.21%低熔点的琼脂糖覆盖,覆盖、固定组织,然后植入10%的中性福尔马林中固定,对于髓核和纤维环边缘不清的三度退变椎间盘,用6mm直径的穿刺针取出椎间盘中央部分,琼脂糖包埋的髓核。荧光抗淬灭封片剂封片,激光共聚焦显微镜下测量细胞大小以及CD44和vimentin在脊索细胞和软骨样髓核细胞内表达的平均荧光强度。结果:应用共聚焦显微镜,可以在新西兰大白兔椎间盘髓核标本中,发现两种细胞:脊索细胞和软骨细胞。两种细胞在大小上有明显的区别,在3月龄新西兰大白兔的椎间盘中,脊索细胞占主要部分。从细胞计数上分析,脊索细胞占全部的80.92%,与软骨样髓核细胞数量有着明显的差异;在3年组新西兰大白兔的椎间盘中,软骨样髓核细胞占主要部分,而脊索细胞数量较3月组明显减少,比例为32.8%,表明脊索细胞数量随年龄的增长而递减,软骨样髓核细胞的数量随年龄递增。Vimentin和CD44平均荧光强度在脊索细胞内明显高于软骨样髓核细胞,两者相比有显着统计学意义。结论:脊索细胞内这两种蛋白的表达强度显着高于软骨样髓核细胞（P<0.01）且与年龄呈负相关,年龄越小,表达越强。提示随着脊索细胞成熟和老化,与脊索细胞调控和发挥功能相关的蛋白表达量逐渐下降。其对周围环境发挥作用亦逐渐减少。第三部分:脊索细胞在兔椎间盘退变过程中的作用和转归目的:对脊索细胞在椎间盘退变过程中的作用的研究方法:新西兰大白兔28只,分3月龄和3年龄两组,每组共14只,3月龄组体重1.5±2.0kg,3年龄组体重3.0-4.5kg左右,雌雄不限。每组中有2只作为正常对照未行手术。每组其余12只进入手术制造椎间盘退变模型。术后2,4,8,16,24周行MRI影像学确认椎间盘退变后,经耳缘静脉注入空气10 mL处死实验动物,获取手术节段和正常自身对照的椎间盘髓核组织,手术节段髓核作为退变组,自身未作处理间隙作为对照组。取下的髓核组织分成两部分,一部分行免疫组织切片后进行HE染色与aggrecan,Ⅱ型胶原和PCNA染色,免疫组织化学染色观察。另一部分-70度保存,RT-PCR检测。结果:椎间盘退变模型显示脊索细胞逐渐消失,被软骨样髓核细胞和不规则的基质取代,3月组兔椎间盘退变模型,前16周脊索细胞PCNA阳性细胞表达率基本保持稳定,16周后显着减少,软骨样髓核细胞的PCNA阳性细胞表达率16周后逐渐增多。3年组脊索细胞PCNA阳性细胞表达率前8周逐渐增高,后逐渐下降;软骨样髓核细胞PCNA阳性表达细胞率前4周基本保持稳定,8周后逐渐增高。结论:实验两个年龄组在出现蛋白多糖和Ⅱ型胶原RT-PCR水平下降,MRI T2像信号出现明显降低后,术后相同时间点3月龄组组织学观测较3年组存在较多的脊索细胞,虽然该细胞在PCNA和aggrecan蛋白水平表达两组无显着差异,但髓核细胞PCNA和aggrecan蛋白水平3月组却明显高于3年组。一定程度显示髓核细胞增殖和蛋白多糖分泌的能力与脊索细胞的数目有关。
周建国,杨述华,杨操,邵增务,徐蔚蔚,郭兵,俞旭东,熊蠡茗[7]（2009）在《烟酰胺对压力诱发兔腰椎间盘退变的保护作用(英文)》文中认为背景:最近研究已经证实,烟酰胺能够促进椎间盘细胞的增殖并对椎间盘退变有改善作用。目的:验证烟酰胺对压力诱发的兔腰椎间盘退变的保护作用。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-11/2009-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室及骨科实验室完成。材料:4月龄日本大白兔24只,体质量2.0kg;烟酰胺为天津市大茂化学试剂厂产品。方法:取24只日本大白兔随机分入1～6组,采用可控轴向压力,以98N压力诱发椎间盘退变建立兔腰椎间盘退变模型,并按分组要求给予兔口服烟酰胺:第1组2只,安装加压装置不予加压或给药;第2组2只,给予50mg/kg烟酰胺口服1周;第3组5只,以98N压力加压1周;第4组5只,以98N压力加压1周,去除压力自行恢复1周;第5组5只,加压1周同时给予50mg/kg烟酰胺口服1周;第6组5只,自加压开始时持续给予50mg/kg烟酰胺,加压1周,然后去除压力后恢复1周。主要观察指标:以Thompson分级法及腰椎间盘磁共振评价退变程度;苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及藏红O-快绿染色考察其组织学改变;P16INK4A免疫组织化学染色检测细胞增殖和衰老状态的变化。结果:①第2组椎间盘未见明显退变;第3组5只动物Thompson分级均为Ⅱ级,第4组4只为Ⅱ级,1只为Ⅲ级,第5组2只为Ⅰ级,3只为Ⅱ级,第6组3只为Ⅰ级,2只为Ⅱ级。MRI也显示,服用烟酰胺的动物椎间盘退变程度有所减轻。②第6组纤维环Ⅱ型胶原含量较第4组高约53.2%（P<0.01）。③第2组藏红O染色强度较第1组有所上升;第5,6组髓核和纤维环染色强度均高于第4组的相对应部位,其中以第6组髓核上升最为明显（P<0.01,P<0.01）,第6组较第5组有轻微上升。④P16INK4A阳性率随烟酰胺给药时间延长而降低。结论:烟酰胺有助于减轻压力对椎间盘的损伤,能够促进压力损伤后的椎间盘恢复。
李高峰,张绍昆,付长峰,王艺昧,闫明,赵松[8]（2009）在《细胞因子及基因治疗椎间盘退行性变的研究动态》文中研究指明椎间盘退行性变主要是由于各种原因导致的细胞因子减少、致炎因子增多并降解细胞外基质,细胞赖以生存的环境被破坏,从而导致椎间盘退行性变。椎间盘为一免疫豁免部位,为椎间盘的细胞因子及其基因治疗提供了有利条件。近年来细胞因子及其基因治疗作为可望从根本上逆转椎间盘退行性变的新方法备受关注。多种细胞因子及其转导入椎间盘的基因可以不同程度的促进细胞外基质合成,从而延缓或逆转椎间盘退行性变。目前的研究还多处于实验阶段,如何延长转入基因表达时间,如何选择一种高效且低毒性的载体等问题将成为以后研究的重点。
潘勇[9]（2007）在《以脱矿脱细胞骨基质环为支架构建组织工程化椎间盘纤维环的实验研究》文中提出下腰痛是现代社会中一种常见病和多发病,流行病学调查发现不但在老年发病率高,而且在青壮年中发病率也非常高,成为导致劳动力丧失的主要原因之一。下腰痛最主要的原因是椎间盘疾病,其中腰椎间盘突出症等椎间盘退变性疾病（disc degeneration disease, DDD）是最常见的椎间盘疾病。随着我国老龄化进程的发展,DDD越来越成为严重影响人民生活和生产的疾病。目前治疗DDD的方法主要有药物、封闭、理疗和手术,其中手术治疗是最有效和最普遍的治疗方法。即使是近几年开展的椎间盘微创手术仍然破坏了椎间盘的结构。手术的后果是椎间隙变窄,脊柱生物力学功能紊乱、退变加速,最终导致不稳需要融合手术稳定节段。融合手术的代价是运动功能的丧失,这种治疗方法与功能重建的现代医学发展方向背道而驰。人工椎间盘假体的远期效果难以令人满意。同种异体椎间盘移植术存在免疫排斥反应和传播疾病的可能,更重要的缺点是来源有限和伦理问题。理论上使用组织工程学技术对椎间盘的生物学修复是最为理想的治疗方法。因此,研究并开发组织工程椎间盘,对椎间盘进行生物学修复和功能重建,已成为治疗退行性椎间盘疾病理想的解决方案。椎间盘包括纤维环和内部的凝胶样核心-髓核两个部分。理论上,纤维环的再生修复是椎间盘组织工程首先要研究的问题,因为破损的纤维环没有自身修复和再生的能力,缺少纤维环的包容,没有任何方法能够让髓核组织填充并保持在椎间隙。只有纤维环完整结构得到恢复的条件下,不同程度的DDD才能进一步治疗:对于椎间盘病变的早期,如果只有纤维环破裂而没有髓核突出,可以使用组织工程化技术来修复纤维环,对髓核的病变可采用刺激逆转退变的治疗,比如各种生长因子的注射、基因修饰细胞注射等;对于病变的晚期,髓核已经突出或脱出需要摘除髓核,就需要组织工程化纤维环和组织工程化髓核共同移植才能达到治疗目的。脱矿骨基质明胶作为支架材料应用在软骨组织工程,在体外成功构建了软骨组织块,证实了脱矿骨基质明胶具有同种异体骨来源广泛、降解过程不会出现其他支架材料的毒性、可以冷冻后长期保持生物学和生物力学性能等特点,肯定了其良好的性能。脱细胞天然组织作为组织工程支架材料在肌腱、血管等的组织工程研究中已经成功广泛应用。能否使用脱矿、脱细胞骨基质作为支架材料用于组织工程化纤维环的构建研究?此支架有何材料和生物力学特点?种子细胞能否粘附支架内部并增殖和行使功能?鉴于文献中没有此方面的报道,为了回答以上问题,本研究使用组织工程学、分子生物学、细胞培养等技术,从制备兔脱矿、脱细胞骨基质环入手展开研究。首先,获得了具有合适理化性能以及低免疫源性的纤维环支架材料。其次,分离培养了兔椎间盘纤维环细胞,在体外进行单层培养和扩增,得到了表型稳定、增殖活力强、数量充足的种子细胞。再次,分别使用静态沉淀法和纤维蛋白凝胶接种技术构建细胞支架复合体,证实了两种方法均能实现细胞粘附和扩增,但后者细胞黏附数量更多、分布更均匀、增殖更快。最后,将构建的细胞支架复合体分别进行体外静态培养和裸鼠皮下培养,经过鉴定证实培养产物为类纤维环组织,更深入地证实了种子细胞在支架内增殖并能够行使生物学功能,其中裸鼠皮下培养产物更接近纤维环组织。研究取得的主要结论总结如下:1.经过脱矿脱细胞塑形等处理获得了与纤维环外形一致的具有多孔结构的支架材料,外周较为致密,有一定的力学强度,内层疏松便于种子细胞种植,环行结构内部空隙为以后组织工程髓核提供空间。其在平均孔径、孔隙度、吸水力等指标上达到了支架材料的要求。具有一定的弹性和未明显下降的降解性。材料的免疫源性比较低,未产生强烈的免疫炎症反应。初步达到了支架材料的基本要求,为进一步深入进行组织工程纤维环的研究奠定了实验基础。2.从兔取椎间盘纤维环组织,使用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶两步酶消化法分离取得纤维环细胞进行接种培养。原代培养的细胞增殖较慢。传代培养的第一代细胞,形态与原代相似,细胞活力未显着下降,具有纤维环细胞的表型特点。第一代细胞增殖汇合速度较原代细胞明显加快,可以快速扩增大量细胞用于组织工程化纤维环的研究。本实验为后续研究提供了表型稳定和数量充足的种子细胞。3.使用培养的第一代纤维环细胞作为种子细胞以及脱矿、脱细胞骨基质环为支架材料,分别使用静态接种技术和纤维蛋白凝胶种植技术构建细胞支架复合体,均可实现细胞黏附于支架并在支架内增殖。采用纤维蛋白凝胶种植技术构建细胞支架复合体较静态接种技术可以使细胞黏附数量更大,分布更加均匀,并且细胞增殖更快。本实验为更好地进行进一步的培养创造了更为有利的条件。4.采用纤维蛋白凝胶种植技术构建的细胞支架复合体,使用体外静态培养方法得到的产物经过检测证实培养产物组织内的细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能,产物可以鉴定为类纤维环组织。5.采用纤维蛋白凝胶种植技术构建的细胞支架复合体,通过裸鼠皮下培养得到的产物,经检测细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能,支架材料大部分吸收,产物较体外培养更接近纤维环组织。组织内细胞增殖持续时间较体外培养长,功能产物分泌更多,所以较体外培养效果更好,从而更好地为生物学修复纤维环奠定基础。
曹晓鹏[10]（2007）在《骨形态发生蛋白4在椎间盘退变中作用的实验研究》文中研究表明本研究用AdEasy方法构建了BMP-4基因的重组腺病毒载体;成功的进行了人退变髓核细胞的原代培养;在人退变椎间盘细胞离体实验中证实了BMP-4基因可以在退变髓核细胞或组织中持续大量表达,并刺激椎间盘基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原的产生,为基因治疗椎间盘退变开辟了新的路径;在椎间盘退变动物模型中定量分析了BMP-4基因治疗对椎间盘基质合成的影响,为椎间盘退变的发病机制研究提出了新的思考。
二、Ad/CMV-hTGF-β1 Treats Rabbit Intervertebral Discs Degeneration in Vivo（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Ad/CMV-hTGF-β1 Treats Rabbit Intervertebral Discs Degeneration in Vivo（论文提纲范文）
（1）Smad3和Smad7在大鼠椎间盘退变过程中的表达及相关性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分椎间盘退变的分子机制及生物治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在校期间发表学术论文 |
| 在校期间获得国家专利 |
| 在校期间参与课题 |
| 致谢 |
（2）人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人退变椎间盘髓核细胞的分离、体外培养 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 实验图片 |
| 第二部分 人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及其诱导分化 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部 实验附图 |
| 第三部分 人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养下的相互影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验附图 |
| 第四部分 TGF-β1 对不同程度退变椎间盘的髓核细胞生物活性的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（4）异体椎间盘复合表达外源性hBMP7因子的髓核细胞构建组织工程椎间盘的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 深低温储存温度及时间对异体椎间盘生物活性的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 重组2型腺相关病毒人BMP7(RAAV2-HBMP7)病毒载体的构建及鉴定 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 介导人骨形成蛋白7 腺相关病毒2 转染髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第四部分 组织工程椎间盘的体外构建 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在肺栓塞动物模型及椎间盘藻酸盐凝胶培养系统中的实验测试研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 丝素蛋白/磷酸钙骨水泥的制备、抗稀散性 及体外凝血实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在骨水泥肺栓塞动物模型中的测试研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 丝素蛋白/磷酸钙骨水泥对藻酸盐凝胶培养系统中椎间盘细胞活性、基质多糖及胶原代谢影响的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 丝素蛋白/磷酸钙骨水泥对椎间盘基因表达影响的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附图 |
| 综述：椎体成形术的相关并发症 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
（6）脊索细胞与椎间盘退变的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分：兔腰椎间盘退变模型建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：不同年龄组兔椎间盘细胞分布类型研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：脊索细胞在兔椎间盘退变过程中的作用和转归 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述（一）椎间盘退变基础研究的最新进展 |
| 综述（二）脊索细胞与椎间盘退变关系研究进展 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间的科研情况 |
| 致谢 |
（8）细胞因子及基因治疗椎间盘退行性变的研究动态（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 学术背景 |
| 2 目的 |
| 3 资料和方法 |
| 3.1 文献检索 |
| 检索人及检索时间: |
| 检索文献时限: |
| 检索数据库: |
| 检索关键词: |
| 检索文献类型: |
| 检索文献量: |
| 3.2 检索方法 |
| 纳入标准: |
| 排除标准: |
| 文献选择: |
| 文献质量评价: |
| 4 文献证据综合提炼 |
| 4.1 椎间盘退行性变的分子生物学 |
| 4.2 细胞因子及基因治疗的应用 |
| 抗分解代谢细胞因子: |
| 促细胞分裂素: |
| 软骨形成素: |
| 细胞内调节因子: |
| 5 问题与展望 |
（9）以脱矿脱细胞骨基质环为支架构建组织工程化椎间盘纤维环的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 以脱矿脱细胞骨基质环为支架构建组织工程化椎间盘纤维环的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脱矿脱细胞骨基质环细胞支架的制备和检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 兔椎间盘纤维环细胞的培养和鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞支架复合体的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 细胞支架复合体体外培养及产物检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 细胞支架复合体裸鼠体内培养及产物检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述 椎间盘生物学修复的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的文章 |
（10）骨形态发生蛋白4在椎间盘退变中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 详细摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论和结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人退变椎间盘髓核细胞模型的建立及AdBMP-4对髓核细胞的作用 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论和结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 AdBMP-4转染对退变髓核组织的作用 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论和结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文献综述 |
| 在读期间主要学术活动 |
| 致谢 |
四、Ad/CMV-hTGF-β1 Treats Rabbit Intervertebral Discs Degeneration in Vivo（论文参考文献）
- [1]Smad3和Smad7在大鼠椎间盘退变过程中的表达及相关性分析[D]. 陈晓辉. 郑州大学, 2017(02)
- [2]人骨髓间充质干细胞与退变髓核细胞体外共培养的实验研究[D]. 李喜功. 苏州大学, 2011(06)
- [3]Combined expression of CTGF and tissue inhibitor of metalloprotease-1 promotes synthesis of proteoglycan and collagen type Ⅱ in rhesus monkey lumbar intervertebral disc cells in vitro[J]. LIU Yong, KONG Jie, CHEN Bo-hua and HU You-gu Department of Orthopaedic Surgery, Affiliated Hospital of Medical College, Qrngdao University, Qingdao, Shandong 266003, China. 中华医学杂志（英文版）, 2010(15)
- [4]异体椎间盘复合表达外源性hBMP7因子的髓核细胞构建组织工程椎间盘的实验研究[D]. 王超锋. 第四军医大学, 2010(06)
- [5]丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在肺栓塞动物模型及椎间盘藻酸盐凝胶培养系统中的实验测试研究[D]. 丁涛. 苏州大学, 2010(10)
- [6]脊索细胞与椎间盘退变的相关性研究[D]. 李朝顶. 苏州大学, 2010(10)
- [7]烟酰胺对压力诱发兔腰椎间盘退变的保护作用(英文)[J]. 周建国,杨述华,杨操,邵增务,徐蔚蔚,郭兵,俞旭东,熊蠡茗. 中国组织工程研究与临床康复, 2009(33)
- [8]细胞因子及基因治疗椎间盘退行性变的研究动态[J]. 李高峰,张绍昆,付长峰,王艺昧,闫明,赵松. 中国组织工程研究与临床康复, 2009(02)
- [9]以脱矿脱细胞骨基质环为支架构建组织工程化椎间盘纤维环的实验研究[D]. 潘勇. 第三军医大学, 2007(03)
- [10]骨形态发生蛋白4在椎间盘退变中作用的实验研究[D]. 曹晓鹏. 第二军医大学, 2007(02)