联合[~3H]MK-801体内外放射自显影对局灶性脑缺血大鼠的差异及意义

一、局灶性脑缺血大鼠体内与体外结合[~3H]MK-801放射自显影的差别和意义（论文文献综述）

田星^[1]（2015）在《牛蒡根提取物及二咖啡酰基奎宁酸MQA对神经损伤的保护作用及机制研究》文中研究表明随着人口的老龄化,神经退行性疾病的发病率呈逐年增高的趋势。NMDA受体所介导的谷氨酸兴奋性毒性在神经退行性疾病的发生和发展中起着重要作用。NMDA受体过度激活导致钙离子大量内流,触发下游凋亡通路,造成神经元损伤。近期研究提示,由NR2A或NR2B亚单位组成的NMDA受体往往表现出对神经损伤不同的作用。由于非选择性NMDA受体拮抗剂在临床应用中未取得满意的疗效,寻找选择性作用于NMDA受体的NR2B亚单位拮抗剂成为治疗神经退行性疾病的研究热点。而同时具有清除自由基作用的NR2B亚单位拮抗剂,从多个途径阻断神经损伤的发生和发展,很有可能成为一类新的有效的神经保护剂。目的:本课题通过计算机虚拟筛选技术,从天然药物中寻找作用于NMDA受体NR2B亚单位的拮抗剂,并阐明牛蒡根乙酸乙酯萃取层（EAE）及1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-苹果酸甲酯）-奎宁酸（MQA）的抗神经损伤作用机制,为发现具有神经保护活性的先导化合物提供理论依据。方法:（1）通过计算机辅助药物设计技术,对中国传统中药数据库中的41491个天然产物进行虚拟筛选,以筛选出与NMDA受体NR2B亚单位结合较好的化合物。对这些化合物进行分析总结,以进一步寻找含有这些化合物具有潜在神经保护活性的中草药。（2）通过建立体外兴奋性毒性和氧化应激损伤模型,采用MTT法考察所筛选中草药提取物的神经保护作用。（3）通过乳酸脱氢酶释放量、Hoechst 33342荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染、抗氧化能力、钙离子内流、ROS和线粒体膜电位（MMP）等实验考察EAE和MQA的保护作用,同时采用Western Blot法检测细胞内Bax/Bcl-2,cleaved caspase-3,ERK,JNK,p38和NR2B等蛋白的表达,初步探索其抗兴奋性毒性和氧化应激损伤的神经保护作用机制。结果:（1）最终筛选到200个与NMDA受体NR2B亚单位结合较好的化合物,来源于91种中草药,其中19种中草药所含化合物有抗神经损伤活性及作用于NMDA受体的文献报道,39种中草药所含化合物有文献报道抗神经损伤活性,但靶点尚不清楚,其余的33种中草药所含化合物抗神经损伤活性未见报道。（2）体外活性测试结果中首次发现牛蒡根、地骨皮、莲子和千里光的神经保护作用,其中牛蒡根的保护作用最强。（3）在谷氨酸诱导PC12细胞损伤模型,EAE可显着增加细胞存活率和抑制LDH释放;EAE显着增加GSH-Px和SOD的活性,减少ROS的产生和MMP的下降;EAE还可降低Bax/Bcl-2的比例,抑制谷氨酸诱导的cytochrome c释放、cleaved caspase-3的蛋白表达增加以及ERK、JNK、p38磷酸化（p<0.05）。（4）在过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型,EAE可显着增加细胞存活率和抑制LDH释放;EAE抗氧化能力较强,通过提高细胞内GSH-Px和SOD的活性,减少MDA含量、ROS生成和MMP的下降;EAE 还可降低 Bax/Bcl-2 的比例,抑制 cytochrome c 释放、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达和酶活性（p<0.05）。（5）在NMDA诱导的SH-SY5Y细胞兴奋性毒性损伤模型,MQA呈剂量依赖性的增加细胞存活率和抑制LDH释放,降低NMDA诱导的SH-SY5Y细胞早期凋亡率;MQA降低Bax/Bcl-2的比例,抑制cytochrome c释放,以及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白表达和酶活性;MQA抑制NMDA诱导的ERK、p38和JNK磷酸化,提高CREB、AKT和GSK-3β的磷酸化水平;此外,MQA可抑制NMDA诱导的钙离子内流,降低NR2B亚单位的表达（p<0.05）。（6）在过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型,MQA显着增加细胞存活率和抑制LDH释放,提高SOD的活性,降低MDA含量、ROS产生以及细胞凋亡;MQA降低 Bax/Bcl-2 的比例,抑制 cytochrome c 释放,以及 cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9的蛋白表达;MQA抑制过氧化氢诱导的ERK磷酸化,提高AKT和GSK-3β的磷酸化水平（p<0.05）。结论:（1）计算机辅助药物设计虚拟筛选有助于快速、准确的筛选以NMDA受体NR2B亚单位为靶点的具有神经保护活性的化合物;（2）EAE对谷氨酸诱导兴奋性毒性的保护作用机制与抑制线粒体凋亡途径相关蛋白表达和ERK,JNK,p38磷酸化有关;（3）EAE抗过氧化氢诱导的氧化应激损伤机制与抑制caspase-3和caspase-9的酶活性和线粒体凋亡途径相关蛋白的表达有关;（4）MQA可能通过拮抗NMDA受体NR2B亚单位,抑制NMDA受体过度激活介导的钙内流和线粒体凋亡途径相关蛋白表达,以及作用于MAPKs、AKT/GSK-3β和CREB信号通路,从而发挥抗NMDA兴奋性毒性作用;（5）MQA通过ERK、AKT/GSK-3β信号通路以及抑制线粒体凋亡途径相关蛋白表达发挥抗过氧化氢诱导的氧化应激作用。

高筱雅^[2]（2014）在《体外培养原代皮质神经元重度糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究》文中研究表明研究背景中国脑血管病年均发病率为193-779/10万,死亡率81-441/10万不等,已经成为中国第一位的死因和致残原因。缺血性脑血管病——脑梗死占脑血管病的大多数,其中大面积脑梗死的死亡率可高达80%,且绝大部分导致严重残疾。脑血管病的高发病率、高致死率、高致残率,给社会和家庭带来沉重的负担。如何降低大面积脑梗死的致残率和致死率是目前研究的热点和难点。脑缺血后神经细胞的损害是一系列缺血级联效应的后果,包括线粒体功能紊乱、细胞内钙超载、高钠和低K+、ROS和NO生成增加、兴奋性氨基酸毒性、炎性因子及粘附分子释放增加、微血管阻塞、血脑屏障破坏、Caspase蛋白家族的级联激活等。在梗死后几分钟到几天,不同的病理过程在时间上互相重叠并起到推波助澜的作用。脑梗死病变区按缺血的程度可分为缺血核心区和缺血半暗带区。核心区内细胞因完全缺血、过度激活的兴奋性神经递质／受体的毒性等致使细胞在几分钟内死亡。缺血半暗带区的细胞因缺血后周边侧枝循环的再灌注,还有存活的可能。由于再灌注时间窗只有4.5h,许多患者就诊时核心区的细胞已不可逆死亡,因此靶向干预缺血半暗带区是目前实验研究和临床治疗的主要目标。在脑保护治疗中,治疗性低温是目前被临床证明有效的脑保护措施之一。亚低温通常指28～35℃,而临床广泛应用的是33-314℃。亚低温在颅脑外伤、心肺复苏后缺血缺氧性脑病和新生儿窒息的治疗中都取得了卓着的成绩。但是,亚低温在脑梗死治疗方面的应用近年才刚刚起步,实验室及临床的证据尚不充足。我们前期的研究表明,亚低温可以缩小MCAO大鼠的梗死灶面积,但是神经功能评分并没有随之改善,因此需要进一步采取措施提高疗效。此外,亚低温治疗也有许多副作用,如寒战,过度镇静抑制呼吸功能,以及长时间亚低温使肺部感染、下肢深静脉血栓等并发症发生率增加等等。因此,有必要联合应用有协同作用的药物,以进一步改善亚低温治疗的效果,改善脑梗死的预后。目前有报道在体外或体内实验中具有神经保护作用的药物很多,从其作用机制来看,包括谷氨酸受体阻滞剂、Y-氨基丁酸受体激动剂、钙离子拮抗剂、自由基清除剂、抗生素和免疫抑制剂、生长因子类、5-羟色胺受体激动剂、膜成分及其稳定剂、脑代谢剂、神经肽类、抗糖尿病药物、激素类、中成药及各种新药等。但是,这些药物在临床转化方面均遇到了障碍。究其原因,除了动物实验设计缺陷、种族差异、药物疗效不够显着、临床应用时机大多晚于实验研究、副作用过大等之外,还因为脑梗死后的损害涉及到多个相互关联、互相重叠的病理机制,而一种药物仅仅作用于缺血级联的一个或某几个环节,作用靶点过于单一,不能对缺血级联产生有效应的结果。基于脑梗死病理机制的复杂性和多样性,联用多种有协同作用的药物或治疗方法有可能取得突破性的效果,如联合非药物性神经保护手段——治疗性低温。在亚低温与神经保护剂联合应用方面国内外均有所涉猎。国内外和我们前期的研究都证实,某些药物如硫酸镁、脑源性神经生长因子等,在与亚低温联用治疗实验动物脑梗死时表现出协同效应。但是,目前国内外尚未有研究对现有的神经保护剂与亚低温联用的疗效进行过系统的筛选。我们根据神经保护剂的作用机制、可获得性、毒性、易用性等特点选取了26种神经保护剂纳入研究。与动物模型和人体实验相比,体外糖氧剥夺／复糖复氧（OGD/R）模型可在体外模拟不同程度的缺血／再灌注状态,实验条件更一致,并能进行高通量的单药或复合药物筛选,耗时耗资少,具有动物模型及人体实验不可比拟的优越性；而神经元细胞是脑组织中的主要细胞,其预后决定了脑组织的总体预后,因此我们首先建立了原代皮质神经元的重度OGD/R模型,然后利用这一模型对26个神经保护剂与亚低温的联合作用进行了筛选。我们选取了细胞活力和凋亡率作为药物筛选的两个主要指标,前者反映活细胞数目的多少,后者反映细胞受损伤的程度。此外,脑梗死后的缺血级联过程中与神经元细胞有关的几个主要环节包括：细胞内钙超载、线粒体膜电位下降、ROS生成、NO生成、Caspase-3的激活,因此我们进一步验证了筛选出的药物与亚低温联合治疗对这些环节的保护作用。研究目的：（1）利用体外培养原代皮质神经元重度OGD/R细胞模型筛选与亚低温具有协同作用的神经保护剂；（2）在原代皮质神经元的体外重度OGD/R模型中,进一步验证联合应用神经保护剂和亚低温对缺血再灌注级联反应的各个环节的保护作用。研究方法：（1）体外培养原代皮质神经元,免疫组化神经元特异标记物β-Tubulin Ⅲ染色鉴定神经元细胞纯度。（2）建立原代皮质神经元体外重度OGD/R模型,体外模拟重度脑缺血／再灌注状态。体外培养原代皮质神经元随机分成5组：OGD1.5h、OGD3h、 OGD4.51h、OGD6h及正常对照组,每组4瓶细胞。OGD各组分别给予OGD1.5h、OGD3h、OGD4.5h. OGD6h后复糖复氧,正常对照组不予处理,48小时后采用Tunnel法测定细胞凋亡率,根据凋亡率选择适当的糖氧剥夺时间作为模型干预时间。（3）确立原代皮质神经元体外重度OGD/R后的最佳亚低温（HT）治疗方案。体外培养原代皮质神经元随机分成10组：HT33℃1.5h.HT33℃3h. HT33℃4.5h.HT33℃6h.HT34℃1.5h.HT34℃3h.HT34℃4.5h. HT34℃6h、OGD/R对照组及正常对照组,每组4瓶细胞。除正常组外所有组给予OGD4.5h后复糖复氧,然后各治疗组采用不同的亚低温水平和时间进行干预：33℃1.5h、33℃3h、33℃4.5h、33℃6h、34℃1.5h、34℃3h.34℃4.5h、34℃6h,OGD/R对照组不予处理,48小时后采用Tunnel法测定细胞凋亡率,以细胞凋亡率最低的亚低温水平和时间作为最佳亚低温治疗方案。（4）筛选神经保护剂的最佳工作浓度：将原代皮质神经元细胞随机分为3-5组,每组6个复孔,给予OGD/R后采用不同剂量的神经保护剂进行治疗,CCK-8试剂盒检测细胞活力,采用细胞活力改变率（ΔCV%）衡量神经保护剂对神经元的保护作用,选取细胞活力改变率最低的药物浓度作为下一步实验时的工作浓度。（5）筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂：将原代皮质神经元细胞随机分为5组,神经保护剂组、HT组、神经保护剂+HT组、OGD/R对照组及正常对照组,每组6个复孔（测细胞活力）或4个瓶（测细胞总凋亡率）。除正常组外各组给予OGD4.5h复糖复氧,然后分别给予神经保护剂、HT、神经保护剂+HT治疗,OGD/R对照组不予任何治疗,正常对照组正常培养,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力变化率,Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞总凋亡率（早期+晚期凋亡率）,筛选出与亚低温联用时对细胞活力变化率和总体凋亡率均有联合保护作用的药物。（6）验证神经保护剂与亚低温对缺血级联的主要环节的联合保护作用：将皮质神经元随机分成5组：神经保护剂组、HT组、神经保护剂+HT组、OGD/R对照组及正常对照组,每组4瓶细胞。除正常组外各组给予OGD4.5h复糖复氧,然后分别给予神经保护剂、HT、神经保护剂+HT治疗,OGD/R对照组不予任何治疗,正常对照组正常培养,JC-1染色流式细胞仪测定线粒体膜电位,DCF-DA染色多功能酶标仪测定线粒体ROS生成,FLUO-3染色流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度,DAF-FM DA染色流式细胞仪检测细胞内NO水平,及Western Blot测定Caspase3表达。统计分析采用随机数法进行分组,用均数士标准差（x±S）描述统计值。用IBM SPSS （Version20.0,USA）软件分析。析因设计先采用析因分析来分析两因素间交互作用,并绘出交互作用图,然后采用两独立样本的t检验来分析各因素的单独效应；多组间两两比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,方差齐的数据用LSD-t检验进行多重比较,方差不齐的数据用Games-Howell检验进行多重比较。P<0.05认为有统计学意义。研究结果（1）原代皮质神经元胞浆和突触被anti-β-Tubulin Ⅲ染色呈红色荧光,胞核被DAPI染色呈蓝色荧光,体外培养原代皮质神经元纯度为97.31±0.831%（2）随着糖氧剥夺时间的延长,原代皮质神经元TUNEL染色阳性率逐渐增高,OGD1.5h、3h、4.5h、6h分别为9.048±3.128%、25.383±5.492%、45.217±20.778%和74.524±11.199%。OGD1.5h组凋亡率与正常对照（5.117±4.157）没有差异,其他各组间均有差异（F=79.986,P=0.000）。OGD6h尽管凋亡率高达74.52±11.199%,但总细胞数也明显减少,因此选择OGD4.5h作为体外原代皮质神经元重度OGD/R模型的干预时间。（3）亚低温水平和亚低温时程之间存在交互作用,交互作用对细胞凋亡率有影响（F=4.108,P=0.009）; OGD/R后细胞凋亡率较正常对照组显着增高,从2.659±1.613%增加至58.227±9.773%（t=19.433,P=0.000）；在OGD/R后给予亚低温治疗,34℃亚低温4.5h凋亡率最低（15.390±3.343%）,与其他各组差异有统计学意义（34℃1.5h:38.886±9.982%,3h:25.253±5.769%,6h:42.938±9.266%;33℃1.5h:40.771±11.723%、3h:35.895±7.122%、4.5h:27.752±7.654%、6h:39.825±12.228%）（F=22.374, P=0.000）（方差不齐,采用单因素ANOVA检验Games-Howell法）。原代皮质神经元重度OGD/R模型最佳亚低温治疗水平为34℃,最佳亚低温时间为4.5h。（4）筛选出26个神经保护剂的最佳工作浓度：白蛋白：5%（F=28.805,P=0.000）；阿托伐他汀：0.1μM（F=9.996,P=0.002）;氯苯氨丁酸：10μM（F=128.964, P=0.000）; BDNF human:25ng/ml（F=13.812, P=0.000）;布美他尼：50μM（F=7.220, P=0.006）;胞磷胆碱：100mM（F=108.716, P=0.000）; CsA:0.01μM（F=4.383, P=0.032）;8-OH-DPAT:100μM（F=96.434, P=0.000）;去铁敏：100μM （F=17.072, P=0.000）;依达拉奉：100μM（F=85.527, P=0.000）;格列苯脲：μM（F=34.426,P=0.000）;格列齐特：10μM（F=113.337, P=0.000）; GM1:1μM（F=10.804, P=0.001）; HUK:0.0015PNA/ml（F=20.374, P=0.000）; MgSO4:3mM（F=66.204, P=0.000）;米诺环素：0.1μM（F=16.638, P=0.000）; MK-801:10μM（F=8.469, P=0.003）;甲强龙：10μM（F=11.968, P=0.001）; Ngb:50nM（F=16.194, P=0.000）;尼莫地平：10μM（F=3.281, P=0.066）; NXY-059:250mM（F=5.821, P=0.013）;孕酮：0.1pM（F=0.565, P=0.580）;利鲁唑：100mM（F=8.506, P=0.003）;丙酮酸钠：10μM（F=36.500, P=0.000）; α-生育酚：1μM（F=79.606, P=0.000）; VAS2870:2μM（F=19.489, P=0.000）=（5） OGD/R后神经元的细胞活力显着降低,随着细胞状态、细胞数的不同,细胞活力下降35-70%不等（t=-64.754～-16.003, P=0.000）0联用亚低温与baclofen（F=8.685, P=0.008）、BUM（F=37.521, P=0.000）、CDPC（F=14.148, P=0.001）、DPAT（F=5.576,P=0.028）、依达拉奉（F=17.712,P=0.000）、格列齐特（F=27.411, P=0.000）、GM1（F=51.121, P=0.000）、MP（F=26.277, P=0.000）、尼莫地平（F=6.404,P=0.020）、丙酮酸（F=10.279,P=0.004）对△CV%有影响。单独效应分析：5个药物：BDNF、格列苯脲、]HUK、MK-801、Ngb与亚低温联用可降低ΔCV%,较单用亚低温（BDNF:t=7.043, P=0.000; GBC:t=2.650, P=0.024; HUK:t=3.600, P=0.009; MK-801:t=5.518, P=0.000; Ngb:t=5.509, P=0.000）或单用药物更佳（BDNF:t=5.507, P=0.000; GBC:t=2.553, P=0.044; HUK:t=3.563, P=0.006; MK-801:t=8.853, P=0.000; Ngb:t=7.282, P=0.000）。（6） OGD/R后细胞总凋亡率从12.138±0.658%增加至26.430±1.706%（t=-15.633, P=0.000）,5个药与亚低温均对总凋亡率有交互作用,HUK、NGB、GBC与亚低温的交互作用对总凋亡率有影响（F=47.458,15.572,9.504；P=0.000,0.002,0.002）。单独效应分析：HUK、MK-801和Ngb与亚低温联用时可降低总凋亡率至13.108±1.006%、15.508±0.938%和11.138±0.893%,比单用亚低温（24.933±1.822%）（HUK:F=11.360, P=0.000; MK-801:F=9.196, P=0.000; Ngb:F=13.595, P=0.000）或药物（HUK:26.270±2.055; MK801:18.725±1.292%; Ngb:18.175±1.181%）（HUK: F=11.504, P=0.000; MK801:F=4.031, P=0.008;Ngb:F=9.504, P=0.000）更佳。（7） OGD/R后线粒体膜电位下降的细胞比例从正常16.703±0.546%升高到31.880±1.877%（t=15.531, P=0.000）。 MK-801和Ngb与亚低温有交互作用；MK-801或Ngb与亚低温的交互作用对OGD/R后神经元的MMP有影响（F=42.474,8.188;P=0.000,0.014）。单独效应分析：联用HUK, MK-801,或Ngb和亚低温降低MMP至12.848±0.448%,13.183±0.613%和19.443±0.706%,较单用药物（HUK:18.130±0.717%, MK-801:20.973±0.423%, Ngb:32.198±1.235%）（HUK:F=12.495, P=0.000; MK-801: F=20.911, P=0.000; Ngb:F=17.933, P=0.000）或亚低温（27.165±0.737%）为佳（HUK:F=33.213,P=0.000; MK-801:F=29.176, P=0.000; Ngb:F=15.138,P=0.000）。（8） OGD/R后神经元ROS相关ODs值自正常19.639±2.688升高达201.596±3.939（t=-93.452, P=0.000）; MK-801和Ngb与亚低温均对ROS有交互作用；联用HUK、MK-801或Ngb与亚低温对ROS生成皆有影响（F=858.166,285.321,973.659; P=0.000）。单独效应分析：联用HUK. MK-801、Ngb和亚低温显着减少ROS依赖性ODs至29.542±2.604,31.712±3.328和33.270±4.458,优于单用药物（HUK:56.63±7.815, MK-801:89.363±11.731, Ngb:69.022±4.667）（F=8.055,11.581,13.569; P=0.000）或亚低温（48.377±5.279）（F=7.839,6.542,5.356; p=0.000）。（9）正常原代皮质神经元细胞内[Ca2+]i依赖性Fluo-3/AM平均荧光强度为1693.000±23.678, OGD/R后增高达3104.250±90.112（t=-30.294, P=0.000）; HUK或Ngb与亚低温有交互作用。联合HUK或Ngb与亚低温对[Ca]i浓度依赖性平均荧光强度有影响（F=18.743,45.911；P=0.001,0.000）。单独效应分析：联用HU、MK-801、Ngb和亚低温显着减少Geo Mean到1817.500±51.157,1794.250±26.837和2212.750±23.908,优于单用药物（HUK:2339.250±47.822,MK-801:2561.000±34.186和Ngb:2576.250±73.781）（F=14.901,35.284,9.374; P=0.000）或亚低温（2330.500±22.986）（F=18.294,30.352,7.101; p=0.000）。（10）正常细胞内NO平均荧光强度（Geo Mean）为1146.500±73.831, OGD/R显着增加细胞内NO的生成达1374.250±110.328（t=-3.431,P=0.017）。三种药物与亚低温对NO相关平均荧光强度均有交互作用；联用三种药物与亚低温均对NO相关平均荧光强度无影响（HUK:F=0.310, P=0.588; MK-801: F=1.555, P=0.593; Ngb:F=0.302, P=0.236）. Ngb （1253.250±100.590）或者Ngb与亚低温联用（1180.500±76.116）均可降低NO生成,联用较单用亚低温（1352.750±82.140）效果为佳（t=3.076,P=0.022）,但并不优于单用Ngb（t=1.153, P=0.296）。其余治疗对NO均无影响（P>0.05）。（11）三种药物与亚低温联用可增加OGD/R后原代皮质神经元Caspase3的表达,较单用亚低温或单用药物更佳。结论联合应用HUK、Ngb、MK-801与亚低温对体外培养OGD/R后的皮质神经元细胞活力及凋亡率有保护作用,并且抑制线粒体凋亡途径的多个环节：减少ROS生成、细胞内钙超载、线粒体膜电位下降以及Caspase-3的激活。

陈春晓^[3]（2013）在《先导化合物TMP-VA抗缺血性脑中风的药理活性及作用机理的研究》文中进行了进一步梳理目前,缺血性脑中风病防治的研究是国内外研究的热点和难点,中药复方以其在以上慢性复杂性疾病的治疗方面具有的显着优势,但因中药复方存在成分不明确,作用机理认识不足等问题,使其临床运用受到了较大的局限,故以中药复方配伍理论为指导,研究和开发结构明确的先导化合物具有重大的研究意义。先导化合物TMP-VA,化学名为4-（3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲氧基）-3-甲氧基苯甲酸-3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲基酯,是以中药复方配伍理论为指导,利用拼合原理,形成的新化合物。我们前期研究发现：（1）TMP-VA可促进神经元生长；（2）TMP-VA能显着延长冰水游泳模型小鼠断头张口呼吸时间；（3）TMP-VA对大脑中动脉栓塞造成的脑缺血损伤有保护作用。在此基础之上,本课题通过培养PC12细胞,建立体外拟缺血模型；建立TMP-VA与脑组织结合率的测定方法,进一步探讨该药对神经细胞的作用及其机理。一、 TMP-VA对PC12细胞的影响及其作用机理的研究目的：观察TMP-VA对体外培养PC12细胞在生理状态、NGF诱导、拟缺血损伤等不同条件下的影响并观察VEGF、 NF-κ B/p65、COX-2的表达情况,探讨TMP-VA对PC12细胞的作用及作用机理。方法：1.PC12细胞的培养及TMP-VA对PC12细胞活性的影响：PC12细胞的生长条件为80%RPMI1640+10%马血清+5%肽牛血清+双抗100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素,37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱中生长；采用MTT法测定TMP-VA对PC12细胞活性的影响。2. TMP-VA对拟缺血损伤的PC12细胞活性的影响：采用氯化钴诱导细胞缺氧的方法,观察PC12细胞在不同浓度和不同时间点活性的变化,从而建立氯化钴化学性拟缺血模型；采用MTT法,观察TMP-VA对拟缺血损伤的PC12细胞活性的影响。3. TMP-VA对分化后PC12细胞活性的影响：对PC12细胞采用无血清饥饿培养12-16h后,以50ng/mLNGF为诱导分化剂,观察PC12细胞的分化情况,从而建立PC12细胞分化模型；采用MTT法,观察TMP-VA对分化后PC12细胞活性的影响。4. TMP-VA对分化后PC12细胞拟缺血损伤活性的影响：参照实验三氯化钴诱导细胞缺氧的方法；采用MTT法,观察TMP-VA对分化后PC12细胞拟缺血损伤活性的影响。5.观察TMP-VA对分化后形态学的影响：采用HE染色法,观察PC12细胞形态学的变化,并通过显微镜测定PC12细胞的分化率,最大细胞直径、最长突起长度及突起数目。6. TMP-VA对分化后PC12细胞拟缺血损伤形态学的影响及作用机理的研究：采用HE染色法,观察PC12细胞形态学的变化；采用ICC染色法,分析VEGF、 NF-KB/p65、 COX-2的表达。结果：1.形成了完善的PC12细胞培养体系,实验结果稳定；成功建立了PC12细胞分化前后拟缺血损伤模型；以150μmol/L氯化钴,作用12-16h为PC12细胞拟缺血损伤造模条件；以300μmol/L氯化钴,作用12-16h为分化后PC12细胞拟缺血损伤造模条件。2.TMP-VA可使正常PC12细胞活性增强,15μmol/L达高峰,7.5μmol/L、5μmol/L30μmol/L、60μmol/L浓度组的OD值显着性高于对照组；TMP-VA对拟缺血损伤的PC12细胞活性并无影响,与模型组比较,各浓度组的TMP-VA的OD值均不存在统计学意义。3. TMP-VA可显着性提高分化后PC12细胞活性,且呈浓度依赖性,与尼莫地平组比较两者效果相当；TMP-VA可提高拟缺血损伤分化后PC12细胞活性,随着浓度的增加,分化后PC12细胞活性逐渐增强,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L浓度组的OD值显着性高于模型组（P<0.01）。TMP-VA各浓度组与尼莫地平组比较,60μmol/L时,分化后PC12细胞活性较低,但不具有统计学差异。4. TMP-VA对分化后形态学的影响形态学改变：（1）对照组：正常PC12细胞可呈多角形,直径约13gm左右,细胞两极极少有突起；细胞折光性好,胞核大而圆,胞浆少；（2）NGF组：与对照组比较,可见细胞体积明显增大,胞核增大,胞浆饱满,胞体均长出长短不一的突起,突起末端有楔状的生长锥,相互交错形成网状；（3）尼莫地平组和TMP-VA组：与NGF组比较,可发现细胞突起增多,突起长度较长。分化率：（1）NGF组：与对照组比较,分化率显着性增高（P<0.01）;（2）TMP-VA组：与NGF组比较,分化率增高（P<0.05）。轴突生长：（1）NGF组：与对照组比较,NGF组细胞体积增大,但不具有统计学意义；而突起长度和突起数目方面同对照组具有统计学差异；（2）TMP-VA组：与NGF组比较,PC12细胞在体积（P<0.05）、突起长度（P<0.05）和突起数目（P<0.01）方面均同NGF组比较具有统计学意义。5. TMP-VA对拟缺血损伤分化后PC12细胞形态学的影响：（1）模型组：胞核固缩、胞浆呈淡红色,出现空泡变性。细胞数量明显减少；（2）TMP-VA组：与模型组比较,部分细胞可见胞核固缩,细胞数量较模型组明显增多。ICC染色结果：（1）VEGF:TMP-VA可减少缺氧时VEGF增加（P<0.05）,且TMP-VA与尼莫地平比较,没有显着性差异；（2）NF-κ B/p65:TMP-VA可减少缺氧时NF-κ B/p65增加（P<0.01）;（3） COX-2:TMP-VA可减少缺氧时COX-2增加（P<0.05）。结论：TMP-VA不具有抗肿瘤活性；TMP-VA对拟缺血损伤的神经元具有特异性保护作用；TMP-VA可提高NGF介导的PC12细胞的分化率,促PC12细胞轴突生长的活性,即TMP-VA具有NGF激动剂活性；TMP-VA可能的作用机理：（1）TMP-VA可能通过减少VEGF的表达,使促血管内皮细胞生长因子和抗血管内皮细胞生长因子重新恢复到平衡状态,拮抗PC12细胞的缺血性损伤而发挥其药理作用；（2）TMP-VA可能通过抑制NF-κ B/p65的激活,从而减少下游因子COX-2的表达,抑制PC12细胞拟缺血后的炎症损伤作用,对神经元有一定的保护作用。二、HPLC法测定TMP-VA与脑组织结合率目的：建立透析外液TMP-VA浓度的分析方法,测定TMP-VA与脑组织结合率。方法：TMP-VA与脑组织在20℃,保温反应2h后,未结合的TMP-VA经平衡透析到达膜外,收集透析外液,再用液液萃取法浓缩TMP-VA,经HPLC测定其含量,代结合率公式,计算结合率。并从线性关系、精密度、重复性、稳定性和萃取回收率等实验进行方法学的考察。结果：在优化的条件下,TMP-VA在2.25-45μg/ml浓度范围内,线性关系良好,得到的得回归方程为：y=25038x+3493,r=0.9995（n=6）；精密度实验的RSD值在1%以下；稳定性实验的RSD值为2.02%,萃取回收率为（87.90±3.06）%,RSD为3.48%。TMP-VA峰面积的RSD值为2.2%,表明样品重复性良好。TMP-VA与脑组织的结合率均在21%以下,结合率均较低。结论：TMP-VA与脑组织的相互作用较弱。三、结语综上所述,TMP-VA具有NGF激动剂活性,并能够有效保护分化后PC12细胞由于缺氧缺血引起的损伤,且在一定定量范围内,随着TMP-VA浓度的增加对拟缺血性细胞的保护作用增强。其作用机理可能为：减少VEGF的表达；抑制NF-κ B/p65的激活,从而减少下游因子COX-2的表达,抑制PC12细胞拟缺血后的炎症损伤作用,产生神经元保护作用。另外,通过TMP-VA与脑组织的结合实验,表明TMP-VA与脑组织的相互作用较弱。

樊红彬^[4]（2013）在《NMDA受体对大鼠SVZ细胞增殖的影响及其机制的研究》文中研究说明背景:有研究表明,无论是离体还是在体神经干细胞上都有NMDA受体的表达,NMDA受体对神经干细胞的增殖、迁移、分化、存活发挥重要作用。在哺乳动物脑内SVZ终身存在神经发生现象,是可能的内源性神经干细胞来源之一。越来越多的证据表明,NMDA受体可能与SVZ的神经发生活动有密切关系。然而NMDA受体是如何参与该区域神经发生的,其调节亚单位在其作用机制中又起到何种作用?在缺血性脑损伤中,NMDA受体亚单位的表达出现了怎样的变化?这些变化和其在缺血性脑损伤中对神经发生的调节机制有着怎样的关系?本研究将分两部分分别对上述问题进行探讨。第一部分目的:通过给予不同时期的新生大鼠NMDA受体及其亚单位激动剂和阻断剂,观察SVZ细胞增殖情况,同时观察NMDA受体及其亚单位激动剂和阻断剂对SVZ神经干细胞增殖的影响。方法:正常新生大鼠随机分成6组,即正常组、NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组、NVP-AAM077组和生理盐水对照组。各组再随机分成P7 d（postnatal 7 days）、P14 d、P21 d、P28 d 4个时间点。在大鼠P3 d时腹腔注射NMDA受体激动剂NMDA（2 mg/kg/d）;选择性非竞争性NMDA受体阻断剂MK-801（10 mg/kg）;NR2A阻断剂NVP-AAM077（10 mg/kg）及NR2B阻断剂Ro25-6981（40 mg/kg）,每个时间点的大鼠在处死前24 h腹腔注射BrdU（50mg/kg）,间隔12 h重复注射一次,再间隔12 h分别灌注取脑,石蜡切片,各组行免疫组织化学染色观察Nestin、BrdU阳性细胞的变化情况,正常组另行HE染色。结果:（1）HE染色结果显示大鼠生后早期SVZ的细胞数和细胞密度随年龄呈下降趋势。BrdU免疫组化结果显示在P7 d时,NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组细胞数较生理盐水对照组减少（P<0.05）;生理盐水对照组和NVP-AAM077组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）。P14 d时NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组细胞数较生理盐水对照组减少（P<0.05）;生理盐水对照组、NMDA组、NVP-AAM077组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）。P21 d时NMDA组、Ro25-6981组细胞数较生理盐水对照组增多（P<0.05）;NMDA组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）;NVP-AAM077组细胞数较MK-801组减少（P<0.05）。P28 d时NMDA组细胞数较生理盐水对照组增多（P<0.05）;NMDA组细胞数较MK-801组增多（P<0.05）。（2）Nestin免疫组化结果显示在P7 d时NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组阳性细胞IOD值较生理盐水对照组降低（P<0.05）;生理盐水对照组、NMDA组和NVP-AAM077组阳性细胞IOD值较MK-801组升高（P<0.05）。P14 d时NMDA组、MK-801组、Ro25-6981组阳性细胞IOD值较生理盐水对照组降低（P<0.05）;生理盐水对照组、NMDA组、NVP-AAM077组阳性细胞IOD值较MK-801组有升高（P<0.05）。P21 d时NMDA组阳性细胞IOD值较生理盐水对照组升高（P<0.05）。P28 d时NMDA组、Ro25-6981组阳性细胞IOD值较对生理盐水照组升高（P<0.05）。结论:生后早期大鼠SVZ存在大量增殖细胞和神经干细胞。适度的激活NMDA受体可以促进SVZ中的细胞增殖,而抑制NMDA受体则会降低SVZ中的细胞增殖,这种抑制作用主要是通过抑制了NMDA受体的NR2B产生。第二部分目的:观察NMDA受体亚单位NR1在正常大鼠及前脑缺血再灌注大鼠SVZ神经干细胞的超微分布及表达变化,初步探讨NR1对缺血性脑损伤中神经发生进行调节的可能机制。方法:线栓法制作大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）2小时再灌注模型,分术后1、3、7、14天4个时间点取脑,之后对正常组、假手术组及MCAO组大鼠分别进行灌注固定,做150mm振动切片,取含SVZ脑片,经梯度蔗糖浸泡,液氮冻融处理后,室温下兔血清封闭;分别通过Nestin免疫组织化学法标记神经干细胞和免疫金-银标记显示NR1,光镜下拍照。之后取Nestin标记阳性细胞脑片行免疫金-银标记显示NR1,光镜下拍照。分别取Nestin、NR1及Nestin/NR1双标记的脑片的阳性部位,大小约1 mm3,经系列脱水,置换,国产618树脂浸润,包埋,聚合,修块,做70 nm超薄切片,经醋酸铀、枸橼酸铅双重染色,透射电镜观察、拍照。结果:（1）光镜下可见,各组大鼠SVZ均可见NR1阳性细胞,假手术组阳性细胞IOD值与正常组比较差异没有统计学意义（P>0.05）。MCAO-组大鼠NR1的IOD值在缺血后1 d开始增加,7 d达到高峰,14 d恢复至3 d水平;同样我们可以发现Nestin免疫组化染色结果中各组大鼠SVZ均可见Nestin阳性细胞,假手术组阳性细胞IOD值与正常组比较差异没有统计学意义（P>0.05）。MCAO-组大鼠Nestin的IOD值在缺血后3 d开始增加,7 d达到高峰,14 d恢复至3 d水平;Nestin/NR1免疫组化染色结果可见各组大鼠SVZ均有Nestin/NR1阳性细胞,假手术组阳性细胞IOD值与正常组比较差异没有统计学意义（P>0.05）。MCAO-组大鼠Nestin/NR1的IOD值在缺血后1 d开始增加,7 d达到高峰,14 d恢复至3 d水平。（2）通过透射电镜观察,大鼠脑SVZ Nestin免疫反应阳性产物呈黑色絮状电子致密物,分布于Nestin免疫反应阳性细胞的胞浆内;NR1免疫反应阳性产物呈黑色颗粒状,分布于SVZ各型细胞的胞膜、胞浆以及高尔基体和粗面内质网;神经干细胞内可见NR1免疫金颗粒与Nestin免疫组化产物共存。阴性对照样本未见任何标记。与正常组及假手术组比较可见脑缺血后SVZ神经干细胞上胞浆内NR1的显着增多,且NR1表达在1 d开始增加,7d达高峰（P<0.05）;此时,神经干细胞增殖达高峰。结论:缺血性脑损伤能够刺激成年大鼠脑SVZ神经干细胞的增殖;（2）脑缺血早期就可诱发SVZ神经干细胞的NR1表达增多,由于此增加模式和脑缺血诱导的神经干细胞增加的时程相一致,提示NR1可能参与SVZ神经干细胞增殖过程。

姜永梅^[5]（2011）在《Ca2+/cbl-b/AKT通路在脑缺血预处理保护机制中的作用研究》文中指出在中国,缺血性脑血管病的发病率排名世界第一,比美国高出一倍。脑卒中已经升为中国第一位死因,死亡率高于欧美国家的4-5倍。我国存活的脑卒中患者中,约有3/4不同程度地丧失了劳动能力,其中重度致残者约占40%,存在偏瘫、失语、智能低下、生活不能自理等残疾,严重影响患者的生存质量。急性脑卒中的治疗目标为限制缺血的严重性及减少缺血持续的时间,以保存缺血半暗带的低灌注区的面积,缺血瀑布理论为急性期的干预提供了治疗靶点。但急性期的治疗干预效果有限,要根本解决脑血管病造成的脑损伤,就要从脑细胞对缺血应激损伤的适应机制上干预治疗。在本研究中,采用了大脑中动脉栓塞法制作了SD大鼠脑缺血预处理（cereb- ral ischemic preconditioning,CIPC）模型,并给予Ca2+调节剂的干预,观测了各组大鼠海马神经元内Ca2+浓度的变化,检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况。评价了神经功能缺损评分及脑组织的梗死体积;应用Western blotting检测Ca2+信号传导通路上的神经钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）、B系淋巴瘤-b（Casitas B-cell lineage lymphoma -b,cbl-b）及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated proteion kinasep B,p-AKT）的蛋白表达,RT-PCR检测cbl-b的转录。以进一步探讨Ca2+信号传导通路在CIPC中的作用机制,及脑神经保护的机制。目的: 1.SD大鼠实验模型制备采用的是局灶性大脑中动脉栓塞法,在本实验中探讨了实验方法的改进,以提高实验的成功率。2.采用TUNEL凋亡检测法检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况,以明确经CIPC及Ca2+调节剂干预后神经元凋亡的情况。3.应用激光扫描共聚焦显微镜检测各组大鼠海马神经元内Ca2+浓度变化情况,已明确CIPC及Ca2+调节剂干预后神经元内Ca2+的浓度变化。4.评价各组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积,以明确CIPC及各种Ca2+调节剂对大鼠神经功能缺损及脑梗死体积的影响。5.应用Western Blot技术检测海马神经元内凋亡相关蛋白CaN、cbl-b及AKT、p-AKT的蛋白表达情况,进一步探讨凋亡相关蛋白在CIPC中的表达变化情况及如何调整神经元的存亡。6.采用RT-PCR技术检测海马神经元内cbl-b的转录变化情况,进一步探讨CIPC对神经元的凋亡的干预是否是从转录水平参与调控的。方法:第一部分:大鼠大脑中动脉栓塞（the occlusion of cerebral middle artery, MCAO）模型制备的改进参考Koizumi线栓方法及焦卓敏局灶缺血模型的方法,做出以下几个方面的调整:1)采用颈部正中偏右侧的手术切口,2)根据大鼠的体重为200-250g,选择的线栓直径为0.26mm,3)应用统一购买的成品线栓,制备CIPC模型,脑缺血模型及假手术模型,并依据是否出现Hornor征、bederson神经功能缺损评分及TTC染色判定模型制备是否成功。第二部分:各组大鼠海马神经元内游离Ca2+及凋亡神经元的检测1.试验动物分组雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、脑缺血组、CIPC组、尼莫地平+CIPC组（尼莫地平组）组、MK801+CIPC组（MK801组）,共5组。2.采用寡核苷酸末端脱氧核糖转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测各组大鼠右侧海马凋亡阳性神经元。3.各组大鼠在预定时间断头取脑后,经分离海马神经元、荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜检测,计算出不同组大鼠的海马神经元内游离Ca2+平均荧光像素值,进行海马神经元游离Ca2+的检测。第三部分:各组大鼠海马神经元内CaN、cbl-b、AKT及p-AKT的蛋白表达1.雄性健康SD大鼠108只,随机分为假手术组、脑缺血组、CIPC组、尼莫地平+CIPC组（尼莫地平组）组、MK801+CIPC组（MK801组）、环孢素A+CIPC组（环孢素A组）组共6组,每组18只。2.采用bederson法评价各组大鼠的神经功能缺损情况及应用TTC染色进行脑梗死体积比较。3.各组大鼠在预定时间点断头取脑,采用RT-PCR及Western Blot检测cbl-b的转录及CaN、cbl-b、AKT及p-AKT的蛋白表达。结果:第一部分1.各组大鼠神经功能缺损评分假手术组神经功能缺损评分均为0分。脑缺血组神经功能缺损评分最高,与脑缺血组比较,CIPC组评分降低明显（P<0.05）。2.各组大鼠脑梗死体积假手术组基本无脑梗死病灶。脑缺血组脑梗死体积最大,CIPC组梗死体积减小明显（P<0.05）。第二部分1.神经元内的游离Ca2+的变化情况缺血组及MK801组大鼠的海马神经元相对荧光像素值最高,两组间差异无统计学意义（P>0.05）;与脑缺血组比较,CIPC组的相对像素值明显减低（P<0.05）;与CIPC组比较,尼莫地平组的相对像素值降低（P<0.05）。2.神经元的凋亡情况假手术组神经元凋亡最少;缺血组及MK801组凋亡的神经元数最多,两组间差异无统计学意义（P>0.05）;CIPC组的神经元凋亡数明显减少,与缺血组比较差异有统计学意义（P<0.05）;尼莫地平组的海马神经元凋亡较CIPC组明显减少,差别有显着的统计学意义（P<0.01）。第三部分1.神经功能缺损评分脑缺血组及MK801组神经功能缺损评分最高,与脑缺血组比较, CIPC组、尼莫地平组及环孢素A组评分降低明显,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;尼莫地平组与环孢素A组评分最低,与CIPC组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;但环孢素A组与尼莫地平组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.脑梗死体积比较脑缺血组及MK801组脑梗死体积最大,CIPC组、尼莫地平组及环孢素A组梗死体积减小明显,与脑缺血组比较,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;尼莫地平组与环孢素A组梗死体积最小,与CIPC组比较,差异有统计学意义（P<0.01）,但环孢素A组与尼莫地平组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3.CaN、cbl-b、AKT及p-AKT的蛋白表达假手术组大鼠CaN、cbl-b蛋白表达极少,与假手术组比较,其他各组大鼠CaN、cbl-b蛋白表达明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。脑缺血组及MK801组大鼠CaN、cbl-b蛋白表达最高,与脑缺血组比较,CIPC组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。与CIPC组比较,尼莫地平组及环孢素A组降低明显,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。但尼莫地平组与环孢素A组比较,差异没有统计学意义（P>0.05）。在各组中,AKT的蛋白表达没有差异。脑缺血组的p-AKT的蛋白表达最低,MK801组与脑缺血组比较,差异没有统计学意义（P>0.05）。CIPC组、尼莫地平组及环孢素A组的p-AKT蛋白表达增高,与脑缺血组比较,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。尼莫地平组及环孢素A组的p-AKT蛋白表达明显升高,与CIPC组比较,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。但尼莫地平组与环孢素A组比较,差异没有统计学意义（P>0.05）。4.cbl-b mRNA转录的变化脑缺血组及MK801组均增加了cbl-b的mRNA水平的转录,两组间差异无统计学意义（P>0.05）;在脑缺血前给予亚致死量的CIPC,降低了cbl-b的转录,较脑缺血组,差异有统计学意义（P <0.05）;尼莫地平组及环孢素A组更加降低了cbl-b在mRNA水平的表达,与CIPC组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;但与尼莫地平组比较,没有转录水平的差异（P>0.05）。结论:第一部分1.采用颈部正中偏右侧手术切口,线栓直径调整为0.26mm,统一购买线栓明显缩短了手术的时间,提高了线栓介入的成功率,减小了大鼠损伤率,提高了MCAO模型制备成功率。第二部分1.CIPC可适量增加神经元内Ca2+浓度,减少海马神经元的凋亡,产生神经保护作用。2.CIPC前给予MK801,抵消了CIPC的保护作用,最终使海马神经元内Ca2+浓度升高,增加了海马神经元的凋亡。3.CIPC前给予尼莫地平可明显降低神经元内Ca2+浓度,减轻海马神经元的凋亡,对神经保护有叠加作用。第三部分1.持续性脑缺血时,细胞内的过量Ca2+作用于钙调蛋白,增加了CaN的表达,在核内促进了cbl-b基因的转录,增加了cbl-b的表达,增强的cbl-b泛素化了PI3K的P85亚基,使PI3K的含量降低,减少了AKT的磷酸化表达,促进了凋亡的发生。2.CIPC抑制了这一过程,减少了CaN及cbl-b的表达,增加了p-AKT的表达,减少神经元的凋亡。3.尼莫地平通过降低神经元内Ca2+浓度,环孢素A抑制了CaN的活性,进一步减少CaN及cbl-b的表达,增加p-AKT的表达。4.MK801抵消了CIPC的神经保护作用,使其在脑缺血时达到了钙超载,增加CaN及cbl-b的表达,抑制p-AKT的表达,促进了细胞的凋亡。

任秀君^[6]（2007）在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中提出研究目的:高脂血症（hyperlipidemia,HLP）由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居三大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“三高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针三阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针三阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针三阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法（ELISA）检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒（术后约1h）后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞（背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。）正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。（nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。）右侧大脑匀浆中NSE（41.70±3.47 ng/dL）及神经营养因子NGF（79.36±7.07 pg/ml）、BDNF（5.66±0.86μg/L）、bFGF（51.20±6.05 ng/L）含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区（背外侧伸展、侧脑室外侧壁）、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“三阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。

施昱丞^[7]（2007）在《针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠星形胶质细胞影响的实验研究》文中指出研究目的:近年来脑血管病的发病率呈现较快的上升趋势,该类疾病的致残率和病死率较高。动脉粥样硬化是脑血管病的基本病因之一,而血脂代谢紊乱可致动脉粥样硬化,这在国内外许多研究报道中已证实;血脂异常与脑血管疾病密切相关。高脂血症是引起和加重动脉粥样硬化的病理基础,是导致脑血管疾病的重要危害因素;高脂血症约占整个脑卒中发病率的1/3,因此,降低血脂对减少脑血管疾病的发病率具有重要的意义。在临床上脑血管病患者大多有高脂血症,而高脂血症患者在脑卒中后,会因原本的血脂代谢紊乱,更加重脑缺血后损伤,比单纯性脑缺血损伤更严重;有效地调节血脂水平就可预防脑血管疾病的发生。因此寻找适当有效的早期干预防治措施是针灸临床与实验研究的重要课题之一。研究方法:（1）首先以高脂饲料喂养大鼠造成高脂血症大鼠后,采用氯化铁（FeCl3）化学诱导大脑中动脉血栓闭塞模型法,将高脂血症大鼠造成高血脂合并脑缺血模型,将动物随机分为八组,电针术前干预及脑缺血后全程治疗;（2）应用生化法观察高血脂大鼠脑缺血后血脂四项变化及针刺的影响;（3）应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况;应用形态学方法观察缺血侧及海马区大脑病理改变状况及针刺的作用;（4）采用免疫组化方法观察针刺前后大鼠缺血侧及海马区星形胶质细胞表达GFAP、HSP70、S-100β、vimentin等的变化;（5）通过双抗夹心ABC-ELISA法,测定脑匀浆中神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量。结果:1.经典高脂配方饲料喂养所致的高血脂模型较为理想,然后采用氯化铁（FeCl3）化学诱导大脑中动脉血栓闭塞模型法,将高脂血症大鼠造成高血脂合并脑缺血模型。以大鼠血脂四项的变化,可以作为大鼠高血脂模型检测的方法之一。2.大鼠在造成脑缺血损伤后,1-2h的神经行为症状均有阳性反应,各脑缺血模型组神经行为症状评分显着高于正常对照组和高血脂模型组,脑缺血模型各组行为症状评分总体高于各针刺组,针刺各组有减少评分趋势。提示针刺可以降低大鼠神经行为症状评分,改善神经功能缺损体征。3.针刺可以通过降低总胆固醇、低密度脂蛋白,升高高密度脂蛋白的含量,有效地调节血脂水平。4.在单纯高血脂大鼠海马区、缺血区,与正常对照组比较,高血脂模型组的GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的阳性细胞个数、面密度、光密度减少,经针刺治疗7d后,与高血脂模型组比较,高血脂治疗组的GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的阳性细胞个数、面密度、光密度增加。而在脑缺血损伤发生后,在大鼠海马区、缺血区GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的阳性细胞个数、面密度、光密度显着增加;经针刺治疗7d后,与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组的GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的阳性细胞个数、面密度、光密度增加。在高脂血症大鼠造成高血脂合并脑缺血模型后,与脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组在大鼠海马区、缺血区GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的阳性细胞个数、面密度、光密度降低。而与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异, p<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅱ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅰ组GFAP、HSP70、S-100β及vimentin等的各项升高均有极显着差异,p<0.01;5.NGF、BDNF及bFGF的含量:脑缺血治疗组>脑缺血模型组>正常对照组;正常对照组>高血脂治疗组>高血脂模型组。与正常对照组比较,高血脂模型组及高血脂合并脑缺血模型组的NGF、BDNF及bFGF含量均极显着低于正常对照组（P<0.01）;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组及高血脂合并脑缺血治疗Ⅱ组的NGF及bFGF含量均极显着高于高血脂合并脑缺血模型组（P<0.01） ;高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组的BDNF含量极显着高于高血脂合并脑缺血模型组（P<0.01）,高血脂合并脑缺血治疗Ⅱ组的BDNF含量高于高血脂合并脑缺血模型组,但二者无差异（P>0.05）;高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组及高血脂合并脑缺血治疗Ⅱ组的NGF及BDNF含量均极显着高于高血脂合并脑缺血模型组（P<0.01） ;高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组的bFGF含量高于高血脂合并脑缺血治疗Ⅱ组。结论:1.本实验首先选用经典高脂饲料喂养大鼠6周造成高血脂模型后,接着再用FeCl3化学诱导大脑中动脉血栓闭塞模型法造成局灶性脑缺血,最终二种模型结合造成高血脂合并脑缺血模型。高血脂合并脑缺血模型建立成功,将可为往后的针刺对高血脂合并脑缺血大鼠星形胶质细胞影响的各种实验研究及探究高血脂合并脑缺血的发病机理提供正确的动物模型。2.脑缺血损伤过程中,高脂血症可加重脑缺血损伤程度;3.针刺可以通过降低总胆固醇、低密度脂蛋白,升高高密度脂蛋白的含量,有效地调节血脂水平。4.持续电针治疗可使星形胶质细胞表达GFAP、HSP70、S-100β、vimentin及大脑中神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量,在相当长时间内保持较高水平,有利于受损神经元的修复;电针介入治疗时间点有其重要性,电针早期介入治疗可能是治疗高血脂合并脑缺血疾病的良策,而电针持续增高星形胶质细胞表达GFAP、HSP70、S-100β、vimentin及持续增高大脑中神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量,可能是电针抗高血脂合并脑缺血损伤的重要机制之一。

黄艳君^[8]（2006）在《电刺激小脑顶核（FNS）对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体神经干细胞增殖、迁移的影响》文中提出背景脑血管病以其高发病率和高致残率成为当前严重威胁人类健康的一类重要疾病,其中以缺血性脑血管病为最常见。大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）是缺血性脑血管病中最常见的一种,治疗的关键在于挽救缺血半暗带濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复,但目前在临床上能得到普遍公认的治疗方法相当缺乏,且绝大多数药物的临床疗效均不理想。神经干细胞（neural stem cell,NSC）的发现并体外培养成功,为中枢神经系统（central nervous system,CNS）功能重建和神经再生提供了新的思路。目前已公认的两个神经发生（neurogenesis）区域为侧脑室外侧壁的脑室下区（subventricular zone,SVZ）和海马齿状回（dentate gyrus,DG）的颗粒下层（subgranular layer,SGL）,另外在哺乳动物的脊髓、隔区、纹状体也分离出了神经干细胞。这预示着神经干细胞广泛存在于成年哺乳动物的中枢神经系统,能不断地产生新的神经元与胶质细胞,为治疗和治愈脑缺血提供了可能。成年脑内神经干细胞在正常情况下大多处于静息状态,只有在某

贾秀川^[9]（2006）在《参附注射液对脑缺血再灌注损伤保护作用的系列研究》文中研究表明第一部分线栓法兔局灶性脑缺血/再灌注模型的制作及影像学评价目的:探讨建立稳定的线栓法兔脑缺血/再灌注模型,并对其进行MR影像学和神经功能评价。方法:健康新西兰白兔40只,随机分为三组:A组5只,进行颈内动脉血管造影检查;B组5只,为假手术组;C组30只,选择直径0.45mm的导丝直接从CCA经ICA插至MCA起始部,3h后抽回导丝至CCA内进行线栓法局灶性脑缺血/再灌注模型的制作,并利用MRI和神经功能缺损评分对模型进行评价。结果:血管造影可以清晰地显示颈内动脉的走行及其颅内分支情况,22只动物脑缺血/再灌注模型成功。MRI能清晰显示脑组织的病理改变,脑缺血/再灌注后1h神经功能缺损评分为2.8±0.45。结论:采用直径0.45mm的导丝直接从CCA经ICA插至MCA起始部,再灌注时,抽回导丝至CCA内可用于建立较稳定（22/30）、长期存活并适合影像学研究的脑缺血/再灌注模型。第二部分兔局灶性脑缺血再灌注损伤后的MRI表现和病理改变对照研究目的:研究兔局灶性脑缺血/再灌注损伤后的系列MRI动态演变过程,并将其与病理改变相对照。方法:健康新西兰白兔27只,随机分为二组:A组5只,为假手术组;B组22只,为线栓法局灶性脑缺血/再灌注模型组。于缺血3h/再灌注后1h（4只）、3h、6h、12h、1d、3d、7d（各3只）行头颅MR扫描,扫描序列包括T1WI、T2WI、FLAIR（液体衰减反转恢复）、DWI（弥散加权成像）、PWI（灌注加权成像）及强化后T1WI扫描,观察缺血再灌注后脑组织T2WI、DWI、PWI、强化后T1WI信号参数以及梗死体积的改变。兔脑切片光镜HE染色及电镜下观察缺血区组织形态学变化,同时应用免疫组化法观察缺血区GFAP、MAP-2、HSP-70及MMP-9的演变过程。

吴正国^[10]（2006）在《通心络对实验性脑缺血保护作用的理论探讨和机制研究》文中研究说明脑血管疾病是严重危害人类健康的疾病,是人类致残和死亡的重要原因之一,其中以缺血性脑血管病最为多见。目前溶栓治疗和神经保护治疗是缺血性脑血管病的两大干预策略。溶栓治疗受到严格的时间窗限制,同时可带来脑出血的副作用。神经保护研究虽越来越受到重视,但迄今仍没有公认的具有显着临床疗效的神经保护剂。相对于溶栓治疗和神经保护研究而从血管保护角度开展脑血管疾病治疗研究,未引起足够的重视。本实验从通心络对实验性脑缺血大鼠脑微血管和神经元保护两方面,探讨其对缺血脑组织的保护作用及其可能机制。目的:在既往研究提出的络病研究的理论框架——“三维立体网络系统”和“脉络-血管系统病”新概念指导下,应用络病理论探讨缺血性脑血管病的病理机制及治疗。通过“脉络-血管系统病”代表方通心络对实验性脑缺血大鼠脑微血管保护、行为学和组织形态学的影响、血清和脑皮层中自由基、脑皮层氨基酸、神经元钙超载、神经细胞凋亡的影响,探讨其对缺血脑组织的保护作用及其可能机制,为络病理论在缺血性脑血管病应用中的科学价值提供实验数据支持,开辟不同于既往的新治疗途径。方法:理论探讨:总结历代文献关于缺血性脑血管病的论述,并结合现代缺血性脑血管病的研究进展,在络病理论指导下深入探讨缺血性脑血管病的中医病理机制及治疗,为进一步深入开展通心络实验研究提供理论支持。实验研究:1通心络对实验性脑缺血脑微血管的保护作用:用清洁级雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、MK-801组、通心络小剂量、通心络大剂量组。假手术组只做颈总动脉和颈内动脉分离。其余四组均以线栓法制备大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型（MCAO）, MK-801组（0.5mg/kg.d）在造模成功后术后腹腔注射,每日一次;通心络大剂量组（1.0g/kg.d）、小剂量组（0.5g/kg.d）均在造模成功后灌胃,假手术组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,各组分别于术后6h、12h、24h、

二、局灶性脑缺血大鼠体内与体外结合[~3H]MK-801放射自显影的差别和意义（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、局灶性脑缺血大鼠体内与体外结合[~3H]MK-801放射自显影的差别和意义（论文提纲范文）

（1）牛蒡根提取物及二咖啡酰基奎宁酸MQA对神经损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）

（2）体外培养原代皮质神经元重度糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究（论文提纲范文）

（3）先导化合物TMP-VA抗缺血性脑中风的药理活性及作用机理的研究（论文提纲范文）

（4）NMDA受体对大鼠SVZ细胞增殖的影响及其机制的研究（论文提纲范文）

（5）Ca2+/cbl-b/AKT通路在脑缺血预处理保护机制中的作用研究（论文提纲范文）

（6）针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响（论文提纲范文）

（7）针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠星形胶质细胞影响的实验研究（论文提纲范文）

（8）电刺激小脑顶核（FNS）对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体神经干细胞增殖、迁移的影响（论文提纲范文）

（9）参附注射液对脑缺血再灌注损伤保护作用的系列研究（论文提纲范文）

（10）通心络对实验性脑缺血保护作用的理论探讨和机制研究（论文提纲范文）

四、局灶性脑缺血大鼠体内与体外结合[~3H]MK-801放射自显影的差别和意义（论文参考文献）

• [1]牛蒡根提取物及二咖啡酰基奎宁酸MQA对神经损伤的保护作用及机制研究[D]. 田星. 沈阳药科大学, 2015(01)
• [2]体外培养原代皮质神经元重度糖氧剥夺/复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究[D]. 高筱雅. 南方医科大学, 2014(01)
• [3]先导化合物TMP-VA抗缺血性脑中风的药理活性及作用机理的研究[D]. 陈春晓. 北京中医药大学, 2013(10)
• [4]NMDA受体对大鼠SVZ细胞增殖的影响及其机制的研究[D]. 樊红彬. 南京医科大学, 2013(12)
• [5]Ca2+/cbl-b/AKT通路在脑缺血预处理保护机制中的作用研究[D]. 姜永梅. 大连医科大学, 2011(06)
• [6]针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响[D]. 任秀君. 北京中医药大学, 2007(02)
• [7]针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠星形胶质细胞影响的实验研究[D]. 施昱丞. 北京中医药大学, 2007(02)
• [8]电刺激小脑顶核（FNS）对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体神经干细胞增殖、迁移的影响[D]. 黄艳君. 重庆医科大学, 2006(01)
• [9]参附注射液对脑缺血再灌注损伤保护作用的系列研究[D]. 贾秀川. 河北医科大学, 2006(11)
• [10]通心络对实验性脑缺血保护作用的理论探讨和机制研究[D]. 吴正国. 河北医科大学, 2006(11)

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